捻轉(zhuǎn)血矛線蟲基因Hc38保守結(jié)構(gòu)域所在部分的克隆、表達(dá)及免疫保護(hù)性試驗(yàn).pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchus contortus)是毛圓科(Trachostrongylidae)血矛屬(Haemonchus)消化道線蟲,感染牛、綿羊、山羊及其他反芻動(dòng)物,引起動(dòng)物貧血及貧血綜合癥,嚴(yán)重的可致動(dòng)物,特別是羔羊大批死亡,給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前,主要采用化學(xué)藥物治療該病,但藥物殘留嚴(yán)重,加之抗藥性蟲株的出現(xiàn)和蔓延,使得化學(xué)治療方法受到了嚴(yán)重挑戰(zhàn)。應(yīng)用免疫學(xué)方法防治該病十分迫切和必要。 Hc38基因

2、在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲腸上皮微絨毛內(nèi)高豐度表達(dá),據(jù)推測(cè)它的表達(dá)產(chǎn)物是一種重要的功能蛋白,與其吸血和免疫逃避機(jī)制有關(guān)。該基因表達(dá)產(chǎn)物的196-512位氨基酸構(gòu)成的保守結(jié)構(gòu)域?qū)儆诠δ芪粗牡鞍准易錺f04910,該家族目前有71條蛋白序列登錄在GeneBank上,它們分屬于45種生物,其中的14種為人類或動(dòng)物的重大血源性疫病病原或傳播媒介。GenBank中注冊(cè)了該抗原基因的全序列,然而他的功能國內(nèi)尚無相關(guān)資料報(bào)道。為此,作者開展了以下研究：

3、 1.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc38保守結(jié)構(gòu)域部分基因的克隆、鑒定及分析 根據(jù)GenBank發(fā)表的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc38基因序列,設(shè)計(jì)1對(duì)引物。以綿羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲雌性成蟲總RNA為模板,采用RT-PCR技術(shù),擴(kuò)增出大小約為429bp的產(chǎn)物,回收目的片段并克隆入pMD 19-T載體,通過限制性內(nèi)切酶NcoI和EcoRI雙酶切、PCR、序列測(cè)定等方法對(duì)重組子進(jìn)行鑒定：測(cè)序結(jié)果與GenBank中AY749124序列同源性為99％。 2.捻

4、轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc38保守結(jié)構(gòu)域部分基因的原核表達(dá)及重組蛋白特異性分析 將Hc38保守結(jié)構(gòu)域部分所在基因亞克隆到原核表達(dá)載體pPROEXHTa,雙酶切和PCR鑒定篩選出陽性重組質(zhì)粒。IPTG誘導(dǎo)后,SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)重組Hc38保守結(jié)構(gòu)域蛋白在DH5a中表達(dá),且以包涵體形式存在。重組蛋白變性、復(fù)性、純化后,通過Western blot測(cè)定具有免疫特異性。 3.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲重組Hc38保守結(jié)構(gòu)域部分基因抗原綿羊免疫保護(hù)性