剛地弓形蟲(chóng)peroxiredoxin基因的克隆、表達(dá)、純化及免疫保護(hù)性研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 對(duì)剛地弓形蟲(chóng)peroxiredoxin(TgPrx)基因進(jìn)行克隆、表達(dá)、純化，分析其免疫原性，觀察TgPrx免疫小鼠誘導(dǎo)的黏膜及系統(tǒng)免疫應(yīng)答及其抗弓形蟲(chóng)感染的能力，探討TgPrx作為弓形蟲(chóng)疫苗候選抗原的可能性。 實(shí)驗(yàn)方法: 第一部分：構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a/TgPrx，并在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性蛋白。收集、純化RH株弓形蟲(chóng)速殖子，提取總RNA；設(shè)計(jì)合成引物并引入EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)，R

2、T—PCR擴(kuò)增編碼TgPrx的基因片段克隆到原核質(zhì)粒pET30a中，經(jīng)雙酶切、PCR及測(cè)序鑒定陽(yáng)性克??；在大腸桿菌BL21/DE3中用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS—PAGE進(jìn)行鑒定。 第二部分：對(duì)原核系統(tǒng)表達(dá)的rTgPrx進(jìn)行純化、免疫原性分析并制備抗血清。大量表達(dá)rTgPrx可溶性蛋白，以Ni—NTA層析法純化蛋白，用兔抗弓形蟲(chóng)血清做Westen blotting分析其免疫原性；以純化的TgPrx皮下注射免疫Wista

3、r大鼠，ELISA測(cè)定血清中抗體滴度；純化的重組rTgPrx蛋白加入不同濃度的蛋白酶抑制劑——苯甲基磺酰氟(Phenylmethane sulfonyl fluoride，PMSF)，觀察該蛋白的降解情況；采用免疫組化方法，對(duì)Prx做初步定位。 第三部分：觀察不同劑量rTgPrx滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)的黏膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答及抗弓形蟲(chóng)感染作用。BALB/c小鼠75只隨機(jī)分為5組，免疫組分別用10μg、20μg、30μg、40μg rTg

4、Prx/只滴鼻免疫小鼠3次，各間隔2周，rTgPrx(溶于20μL PBS中，對(duì)照組用等量PBS滴鼻。末次免疫后第14d，用1×104個(gè)速殖子/只灌胃攻擊全部小鼠，觀察小鼠健康狀況。攻擊后第30 d，眼靜脈叢采血，頸椎脫臼處死小鼠，檢測(cè)腸液IgA和血清IgG，計(jì)數(shù)肝、腦組織內(nèi)弓形蟲(chóng)速殖子，分離并計(jì)數(shù)腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(intestinal intraepithelial lymphocytes，IEL)及脾淋巴細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:

5、 從弓形蟲(chóng)RH株cDNA中擴(kuò)增出591 bp的TgPrx基因片段，并成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a/TgPrx；SDS—PAGE結(jié)果表明，目的基因在大腸桿菌BL21/DE3中高效表達(dá)，相對(duì)分子量(Mr)約32kDa，比預(yù)期值大約7kDa。 Western blotting顯示純化后的rTgPrx能被兔抗弓形蟲(chóng)免疫血清識(shí)別；免疫大鼠后可誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的特異性抗體，該蛋白在-20℃保存2周時(shí)開(kāi)始降解，反復(fù)凍融可加速其降解；免

6、疫組化結(jié)果顯示大鼠抗TgPrx血清能特異性識(shí)別速殖子中的Prx，Prx分布部位呈棕色反應(yīng)。 攻擊后第7～14 d，小鼠出現(xiàn)豎毛、倦怠、活動(dòng)減少、飲水及采食減少等異常表現(xiàn)，10μg組和對(duì)照組小鼠死亡4只，20μg、30μg組死亡6只，40μg組死亡9只。40μg組肝、腦組織內(nèi)蟲(chóng)荷(速殖子數(shù))顯著低于10μg、20μg、30μg組和對(duì)照組(P＜0.05)，40μg組血清IgG、IEL及脾淋巴細(xì)胞數(shù)量均高于對(duì)照組(P＜0.05)，腸