應(yīng)用RNAi技術(shù)研究捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc38基因的生物學(xué)功能.pdf

1、Hc38基因在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲腸上皮微絨毛內(nèi)高豐度表達(dá)，據(jù)推測(cè)它的表達(dá)產(chǎn)物是一種重要的功能蛋白，與其吸血和免疫逃避機(jī)制有關(guān)，但對(duì)其功能研究的相關(guān)內(nèi)容尚未見報(bào)道。該基因表達(dá)產(chǎn)物的196-512位氨基酸構(gòu)成的保守結(jié)構(gòu)域?qū)儆诠δ芪粗牡鞍准易錺f04910，該家族目前有71條蛋白序列登錄在GeneBank上，它們分屬于45種生物，其中的14種為人類或動(dòng)物的重大血源性疫病病原或傳播媒介。本研究將Hc38基因表達(dá)產(chǎn)物保守結(jié)構(gòu)域部分的cDNA片段克隆并

2、構(gòu)建RNAi載體，應(yīng)用RNAi技術(shù)特異性抑制Hc38基因的表達(dá)，對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行探索性研究，為尋找該基因產(chǎn)物保守結(jié)構(gòu)域的功能阻斷劑，并為揭示含有該結(jié)構(gòu)域的蛋白家族的功能奠定基礎(chǔ)。 本研究首先從新疆石河子市屠宰場(chǎng)采集經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的雌性成蟲，采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)Hc38基因產(chǎn)物保守結(jié)構(gòu)域的cDNA片段克隆；通過BLAST分析比對(duì)，表明所克隆的Hc38基因片段與所報(bào)道的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc38基因相應(yīng)序列高度同源，同源性達(dá)

3、99％。目前該序列已登錄在GeneBank上，登錄號(hào)為DQ414466。 接著構(gòu)建了Hc38基因的RNAi重組載體；將Hc38片段與L4440載體連接，所構(gòu)建的RNAi載體經(jīng)雙酶切和PCR鑒定，證明構(gòu)建成功；將構(gòu)建成功的RNAi載體轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌HT115中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，通過飼喂方法導(dǎo)入捻轉(zhuǎn)血矛線蟲三期幼蟲體內(nèi)，24h后，將干擾組和對(duì)照組分別感染綿羊，感染量為每只羊7萬條，于感染后第21、23、25、27、29、31、

4、33、35天對(duì)糞便蟲卵進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)第27、29、31天的蟲卵進(jìn)行了孵化，第35天殺羊取胃，對(duì)雌雄成蟲數(shù)、雌雄蟲畸形率等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并對(duì)雌雄蟲蟲體長度進(jìn)行測(cè)定。 結(jié)果表明，人工感染干擾組幼蟲的綿羊體內(nèi)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵、蟲卵孵化率、雌蟲數(shù)、雄蟲數(shù)、成蟲數(shù)較空載體對(duì)照組分別減少93.39％、86.70％、97.32％、98.58％、98.00％，雌蟲體長和雄蟲體長分別減少41.94％和19.86％，差異均極顯著，干擾組雌蟲畸形率為15