捻轉(zhuǎn)血矛線蟲肌動(dòng)蛋白DNA疫苗的免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)與醛縮酶特性的研究.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchus contortus)屬毛圓科(Trichostrongylidae)血矛屬(Haemonchus)線蟲,是羊(山羊、綿羊)的主要胃腸道寄生蟲之一,常常導(dǎo)致羊特別是羔羊貧血、消瘦、甚至死亡,造成重大經(jīng)濟(jì)損失。目前的主要防治方法是使用抗蠕蟲藥,但由于蟲體抗藥性的產(chǎn)生和蔓延,使得傳統(tǒng)的化學(xué)藥物防治方法受到了嚴(yán)重挑戰(zhàn),隨著公眾對(duì)公共衛(wèi)生關(guān)注程度的提高以及人們對(duì)綠色食品的需求不斷擴(kuò)大,藥物殘留和藥物污染問題已成

2、為限制藥物使用和開發(fā)的重要因素。因此,通過研究免疫學(xué)方法來防止該病已經(jīng)成為當(dāng)前的迫切需要。
　　 本研究進(jìn)行了捻轉(zhuǎn)矛線蟲肌動(dòng)蛋白(Actin,ACT)DNA疫苗免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)；同時(shí)克隆了捻轉(zhuǎn)矛線蟲醛縮酶(Aldolase,ALD)的全長(zhǎng)序列。主要工作如下:
　　 1.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲肌動(dòng)蛋白DNA疫苗的構(gòu)建與體內(nèi)表達(dá)情況的檢測(cè)
　　 利用DNA重組技術(shù),構(gòu)建了pVAX1-ACT DNA疫苗。酶切鑒定正確后,免疫小鼠,1

3、周后取肌肉注射部位、非注射部位組織,用RT-PCR和Western-blot檢測(cè)DNA疫苗的表達(dá)情況。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,小鼠注射部位肌肉所擴(kuò)增出的目的條帶大小約為1131bp,非注射部位中未能檢測(cè)到目的條帶,從而說明重組質(zhì)粒在注射部位可以成功轉(zhuǎn)錄；Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在注射部位檢測(cè)到大小為41kD的目的蛋白的條帶,而非注射部位未能檢測(cè)到目的蛋白的條帶；這些結(jié)果說明本試驗(yàn)成功構(gòu)建了pVAX1-ACT DNA疫苗,

4、為下一步的動(dòng)物保護(hù)性試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲肌動(dòng)蛋白DNA疫苗的免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)
　　 使用DNA疫苗pVAX1-ACT,對(duì)9-10月齡山羊做了免疫保護(hù)性試驗(yàn)。健康山羊15只,隨機(jī)分成3組,每組5只。其中一組每次免疫100μg pVAX1-ACT,其他兩組為不攻蟲對(duì)照組和攻蟲對(duì)照組。在試驗(yàn)山羊的背部皮下多點(diǎn)注射免疫,兩個(gè)對(duì)照組用1ml PBS代替DNA疫苗,共免疫兩次,間隔2周。pVAX1-ACT免疫組和攻

5、蟲對(duì)照組山羊于第二次免疫14天后口腔接種5000條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲第三期感染性幼蟲。從攻蟲后第22至34天,每隔一天采集糞便,蟲卵計(jì)數(shù).攻蟲后35天,屠宰山羊,剖解皺胃,分離雌雄蟲體,分別計(jì)數(shù)。使用DNA疫苗pVAX1-ACT對(duì)山羊做免疫保護(hù)性試驗(yàn)的同時(shí),采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法,測(cè)定了所有試驗(yàn)山羊血清特異性免疫球蛋白IgG滴度、血清以及胃粘膜表面和胃粘膜組織勻漿中特異性IgA濃度。在免疫前、初免后14d,二免后14d、攻

6、蟲后14d和殺羊前對(duì)以下指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè):利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了所有試驗(yàn)山羊外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的變化；利用全自動(dòng)電子血細(xì)胞分析儀對(duì)所有試驗(yàn)山羊的外周血中嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和血紅蛋白進(jìn)行了檢測(cè)；利用ELISA試劑盒對(duì)血清細(xì)胞因子(IFN-γ、TGF-β、IL-4、IL-22)的濃度變化進(jìn)行了檢測(cè)。
　　 結(jié)果顯示:DNA疫苗pVAX1—ACT免疫山羊后,ELISA檢

7、測(cè)結(jié)果表明血清IgG、IgA在首免后14天達(dá)到較高水平,二免后抗體水平進(jìn)一步升高；殺羊后檢測(cè)胃粘膜表面(MS)與胃粘膜組織勻漿(MH)的IgA,發(fā)現(xiàn)胃粘膜組織勻漿具有較高的滴度。在免疫前、初免后14d、二免后14d、攻蟲后14d和殺羊前各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果表明:攻蟲前,免疫組山羊CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞水平、B淋巴細(xì)胞水平顯著高于不攻蟲對(duì)照組。免疫組IL-4水平顯著上升,IFN-γ水平有所下降,但變化不明顯。TGF-β、IL-22

8、變化規(guī)律性不明顯。免疫組山羊的嗜酸性粒細(xì)胞濃度顯著高于不攻蟲對(duì)照組,單核細(xì)胞水平逐漸上升；各組山羊的血紅蛋白濃度沒有明顯差異。攻蟲后,免疫組和攻蟲對(duì)照組山羊CD4+T淋巴細(xì)胞水平、CD8+T淋巴細(xì)胞水平、B淋巴細(xì)胞水平顯著高于不攻蟲對(duì)照組。陽性對(duì)照組的IL-4含量急劇上升,在63天達(dá)到高峰,免疫組和陽性對(duì)照組IL-4濃度顯著高于陰性對(duì)照組。免疫組和攻蟲對(duì)照組山羊嗜酸性粒細(xì)胞濃度顯著高于不攻蟲對(duì)照組,免疫組和不攻蟲對(duì)照組的血紅蛋白水平顯著

9、高于攻蟲對(duì)照組。用5000條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲三期幼蟲攻擊后,pVAX1-ACT免疫組分別在雌蟲、雄蟲和成蟲總數(shù)上比陽性對(duì)照組顯著減少34.10％(P<0.05),31.98％(P<0.05)和33.11％(P<0.05)；陰性對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)成蟲。pVAX1-ACT免疫組蟲卵減少率為34.4％,陰性對(duì)照組始終未檢測(cè)到捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵。說明pVAX1-ACT對(duì)抵御山羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的感染具有一定效果。
　　 3.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲醛縮酶特性的研究

10、
　　 根據(jù)GenBank上登錄的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲醛縮酶(Aldolase)基因EST序列(登錄號(hào)為CB016007,登錄長(zhǎng)度為743bp股計(jì)基因特異性引物,分別利用5’RACE和3’RACE獲得該基因5’端未知區(qū)和3’端未知區(qū),從而拼接得到Aldolage基因的全長(zhǎng)cDNA。將該序列遞交GenBank(登錄號(hào)為HQ529288)。分析發(fā)現(xiàn):該基因全長(zhǎng)1235bp,含有最大開放閱讀框(ORF)為1098bp,5’非翻譯區(qū)(5’UTR

11、)長(zhǎng)27 bp,3’非翻譯區(qū)(3,15TR)長(zhǎng)110bp。根據(jù)Aldolage基因的全長(zhǎng)cDNA設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物,以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的總RNA為模板,采用RT-PCR技術(shù),擴(kuò)增出1098bp的產(chǎn)物,與推導(dǎo)出的ORF長(zhǎng)度一樣。BLAST分析后將該片段克隆到pET-32a(+)載體中,轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3),以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。SDS-PAGE結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)融合蛋白在上清和包涵體中均有表達(dá),分子量約58kDa。以自然感染