利用基因芯片技術篩選奶牛外周血熱應激相關基因.pdf

1、熱應激反應機制的分析與闡釋,對于控制熱應激反應,使動物表現(xiàn)出最佳的生理性能,在高溫環(huán)境下保持正常的生理狀態(tài)和健康體能,都具有重要的理論意義和實際應用價值。因此,對于熱應激反應機制的分析,尤其是其分子遺傳機制的研究,一直都是生命科學研究的一個重要方向。本試驗以金華伊康乳業(yè)奶牛場30頭中國荷斯坦牛和25頭含25％以色列荷斯坦牛血統(tǒng)的雜交中國荷斯坦牛作為研究對象,分別從尾靜脈采8mL血液作為試驗材料。動物間耐熱能力不同,是由其耐熱性狀相關的基

2、因表達差異所決定的。將新鮮的血液分別在42℃熱暴露不同時間,也會引起熱應激相關基因的表達差異。因此采用Affymetix公司的基因表達譜芯片篩選并研究了各組間相同處理及各組內(nèi)不同處理之間的差異表達基因,即熱應激相關基因。芯片結果發(fā)現(xiàn)奶牛的CCL3基因在中國荷斯坦牛熱激1小時和4小時后表達上調(diào),且Genbank上沒有其全序列。因此克隆了奶牛CC13的全長片段,并進行初步的生物信息學分析。
　　 結果如下:
　　 ①將芯片數(shù)

3、據(jù)進行聚類分析,得到差異表達基因257個,其中基因表達上調(diào)139個,基因表達下調(diào)118個。這些差異表達基因主要涉及細胞凋亡(22/4,即上調(diào)基因22個,下調(diào)基因4個,下同)、免疫應答(37/14)、氧化還原(3/8)、細胞增殖與分裂(5/7)、代謝相關(14/19)、信號轉導(14/8)及調(diào)控轉錄(16/5)、其它(26/62)等生物功能和過程。這些過程都與奶牛的熱應激反應息息相關,反映了熱應激過程的分子變化基礎。其中熱休克蛋白家族和趨

4、化因子家族與奶牛的熱應激關聯(lián)尤為緊密。
　　 ②成功克隆了奶牛CCL3的全長cDNA序列,共829bp,其5'UTR較之NM174511延伸了15bp,3'UTR延伸了453bp。其中5'UTR長度為83bp(1～83bp)；開放閱讀框282bp(84～365bp),編碼93個氨基酸:3'UTR464bp(366～829bp)。其中終止密碼子后的407bp處出現(xiàn)動物mRNA中常見的加尾信號AAUAA,其后延伸22bp即出現(xiàn)pol

5、yA尾。發(fā)現(xiàn)在開放閱讀框的+8位T→C,+9位C→G,+10位G→C,+195位T→C突變。且使蛋白的第3位纈氨酸→丙氨酸,第4位丙氨酸→脯氨酸。
　　 ③分析結果顯示奶牛CCL3蛋白是分子量為10117.7D,pI為6.11,親水性評估為0.246,脂溶指數(shù)為83.98的疏水性蛋白。哺乳動物順CCL3蛋白的同源比對結果顯示奶牛CCL3蛋白與亞洲水牛同源性最高為95％,與其他哺乳動物依次為豬88％；貓81％；馬79％:兔和大鼠7

6、5％；犬74％；倉鼠73％；小鼠72％；棉鼠、人和黑猩猩70％,獼猴則僅有66％。
　　 ④在蛋白的信號肽預測、糖基化、磷酸化位點預測中發(fā)現(xiàn)奶牛CCL3蛋白存在信號肽序列,且最可能的切割位點在23S和24A氨基酸殘基間。3A(Ala)丙氨酸和47I(Ile)異亮氨酸殘基可能存在糖基化位點。44S的絲氨酸(Ser)、30T和67T的蘇氨酸(Thr)和38Y的酪氨酸(Tyr)存在磷酸化位點。功能域分析中發(fā)現(xiàn)奶牛CCL3蛋白存在che