香豬生長(zhǎng)相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)與表達(dá).pdf

1、哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)主要受生長(zhǎng)激素、胰島素樣生長(zhǎng)因子的調(diào)控，將生長(zhǎng)激素基因和胰島素樣生長(zhǎng)因子基因作為影響香豬生長(zhǎng)速度的候選基因，克隆并分析基因的組織特異性表達(dá)規(guī)律并研究基因變異與香豬生長(zhǎng)速度性狀表型之間的關(guān)系。 應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)從香豬的基因組文庫(kù)中分離出1.903 Kb生長(zhǎng)激素基因，由五個(gè)外顯子和四個(gè)內(nèi)含子組成。香豬生長(zhǎng)激素基因的堿基序列與已知四個(gè)國(guó)外豬種和9個(gè)中國(guó)地方豬種之間的相似性為97-99％，其間的差異集中在內(nèi)含子2和4

2、，通過(guò)限制性內(nèi)切酶(DdeⅠ，NarⅠand BsmN Ⅰ)分析，鑒定出香豬生長(zhǎng)激素基因的五個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，分別位于5’-側(cè)翼區(qū)274(T/C)位點(diǎn)，外顯子2的622(G/A)和631(G/A)位點(diǎn)，內(nèi)含子2中的841(T/C)以及外顯子4中的1358(A/G)位點(diǎn)。同時(shí)，1358(A/G)位的堿基改變導(dǎo)致香豬生長(zhǎng)激素成熟肽第108位異亮氨酸替換，三維結(jié)構(gòu)分析表明，異亮氨酸的存在可能影響香豬生長(zhǎng)激素與受體的親合力。 為了檢測(cè)香豬生

3、長(zhǎng)激素與受體親和力關(guān)系的變化，將生長(zhǎng)激素成熟肽置于原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。以香豬腦垂體總RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到香豬生長(zhǎng)激素cDNA，長(zhǎng)700bp，回收后與載體pMD18-T相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，篩選陽(yáng)性克隆子，以重組質(zhì)粒為模板，通過(guò)含有Sap Ⅰ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的特異引物將生長(zhǎng)激素基因亞克隆到表達(dá)載體pTYB11上，野生型香豬生長(zhǎng)激素的原核表達(dá)質(zhì)粒pTYB11-wGH；采用定點(diǎn)突變PCR技校構(gòu)建了含有Ile<,108>突

4、變的重組質(zhì)粒pTYB11-mGH。二種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化受體菌ER2566，在IPTG誘導(dǎo)下，二種蛋白在原核細(xì)胞中獲得了表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)的融合蛋白的分子量為78KD，與預(yù)期相符；定量分析結(jié)果顯示，表達(dá)的融合蛋白占菌體總蛋白的10％。該結(jié)果為進(jìn)一步研究GH的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)活性及其與受體的相互作用等奠定了基礎(chǔ)。 胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factors，IGFs)分為工GF-Ⅰ和IGF-Ⅱ二