香豬生長相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)與表達.pdf

1、哺乳動物的生長主要受生長激素、胰島素樣生長因子的調(diào)控，將生長激素基因和胰島素樣生長因子基因作為影響香豬生長速度的候選基因，克隆并分析基因的組織特異性表達規(guī)律并研究基因變異與香豬生長速度性狀表型之間的關(guān)系。 應(yīng)用聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)從香豬的基因組文庫中分離出1.903 Kb生長激素基因，由五個外顯子和四個內(nèi)含子組成。香豬生長激素基因的堿基序列與已知四個國外豬種和9個中國地方豬種之間的相似性為97-99％，其間的差異集中在內(nèi)含子2和4

2、，通過限制性內(nèi)切酶(DdeⅠ，NarⅠand BsmN Ⅰ)分析，鑒定出香豬生長激素基因的五個多態(tài)性位點，分別位于5’-側(cè)翼區(qū)274(T/C)位點，外顯子2的622(G/A)和631(G/A)位點，內(nèi)含子2中的841(T/C)以及外顯子4中的1358(A/G)位點。同時，1358(A/G)位的堿基改變導(dǎo)致香豬生長激素成熟肽第108位異亮氨酸替換，三維結(jié)構(gòu)分析表明，異亮氨酸的存在可能影響香豬生長激素與受體的親合力。 為了檢測香豬生

3、長激素與受體親和力關(guān)系的變化，將生長激素成熟肽置于原核表達系統(tǒng)中表達。以香豬腦垂體總RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴增得到香豬生長激素cDNA，長700bp，回收后與載體pMD18-T相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，篩選陽性克隆子，以重組質(zhì)粒為模板，通過含有Sap Ⅰ和XhoⅠ酶切位點的特異引物將生長激素基因亞克隆到表達載體pTYB11上，野生型香豬生長激素的原核表達質(zhì)粒pTYB11-wGH；采用定點突變PCR技校構(gòu)建了含有Ile<,108>突

4、變的重組質(zhì)粒pTYB11-mGH。二種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化受體菌ER2566，在IPTG誘導(dǎo)下，二種蛋白在原核細胞中獲得了表達，SDS-PAGE檢測表達的融合蛋白的分子量為78KD，與預(yù)期相符；定量分析結(jié)果顯示，表達的融合蛋白占菌體總蛋白的10％。該結(jié)果為進一步研究GH的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)活性及其與受體的相互作用等奠定了基礎(chǔ)。 胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors，IGFs)分為工GF-Ⅰ和IGF-Ⅱ二