雜色鮑MNK、IRR和FGFR基因的克隆、表達(dá)分析及與生長(zhǎng)相關(guān)的SNP位點(diǎn)篩查.pdf

1、雜色鮑(Haliotis diversicolor)是我國(guó)南方重要的養(yǎng)殖鮑種，研究與雜色鮑生長(zhǎng)相關(guān)的基因，分析基因的表達(dá)規(guī)律，并篩查基因中與生長(zhǎng)性狀相關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，對(duì)于深入了解生長(zhǎng)性狀調(diào)控的分子機(jī)制，培育具有優(yōu)良性狀的新品種具有重要意義。本研究將MAPK互作激酶(MAP kinase-interacting kinase，MNK)、胰島素相關(guān)多肽受體(Insulin-related peptide receptor, IRR)和成纖

2、維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(Fibroblast growth factor receptor, FGFR)三個(gè)基因作為雜色鮑生長(zhǎng)的候選基因，通過(guò)對(duì)其克隆、功能驗(yàn)證、SNP位點(diǎn)檢測(cè)及與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析，篩選出對(duì)雜色鮑生長(zhǎng)性狀有重要影響的功能分子標(biāo)記，以期為雜色鮑的分子標(biāo)記輔助選擇育種提供重要依據(jù)。主要結(jié)果如下:
　　1、利用PCR及末端快速擴(kuò)增技術(shù)（RACE）技術(shù)，克隆獲得MNK基因的cDNA全長(zhǎng)序列及開(kāi)放閱讀框（ORF）區(qū)域的基因組D

3、NA序列。MNK基因cDNA全長(zhǎng)3576bp，ORF長(zhǎng)1413bp，ORF區(qū)的基因組DNA序列長(zhǎng)3942bp，包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子。熒光定量PCR(qRT-PCR)結(jié)果顯示，MNK基因在所測(cè)的幼體/胚胎不同發(fā)育階段及成體不同組織都有表達(dá)，胚胎時(shí)期表達(dá)量顯著高于破膜后幼體時(shí)期的表達(dá)量，在成體精巢組織中表達(dá)量最高，在鰓中表達(dá)量最低。通過(guò)整體原位雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MNK基因在原腸胚時(shí)期至圍口殼幼體時(shí)期均有表達(dá)，擔(dān)輪幼體時(shí)期和面盤幼體早期，M

4、NK基因主要在殼腺區(qū)域表達(dá)，面盤幼體中期主要在內(nèi)臟團(tuán)和貝殼處表達(dá)，面盤幼體后期，表達(dá)部位分布在內(nèi)臟團(tuán)和外套膜區(qū)，到達(dá)圍口殼幼體時(shí)期，開(kāi)始在消化腺、外套膜和足部大量表達(dá)。利用高通量測(cè)序手段在6個(gè)包含MNK外顯子的片段中共篩選獲得了5個(gè)與雜色鮑生長(zhǎng)性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn)。選擇與足肌重量和殼的生長(zhǎng)性狀均顯著相關(guān)的位點(diǎn)A1748C，分析MNK基因在該位點(diǎn)三種基因型的足肌和外套膜中表達(dá)量的相互關(guān)系，發(fā)現(xiàn)足肌重量及殼長(zhǎng)、殼寬、殼高、殼重值最高的CC型

5、個(gè)體中MNK基因在足肌和外套膜中的表達(dá)量最高，而生長(zhǎng)性狀平均值最低的AA型個(gè)體，MNK基因在足肌和外套膜中的表達(dá)量最低，說(shuō)明A1748C中等位基因C可能促進(jìn)足肌肉及殼的生長(zhǎng)。
　　2、利用PCR技術(shù)及RACE技術(shù)，克隆獲得IRR基因的cDNA全長(zhǎng)序列及 ORF區(qū)的部分基因組DNA序列。IRR基因cDNA全長(zhǎng)5723bp，ORF長(zhǎng)3054bp，已獲得的ORF區(qū)的部分基因組DNA包含18個(gè)外顯子。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了IRR基因在雜

6、色鮑胚胎/幼體不同發(fā)育時(shí)期及成體不同組織的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)雜色鮑IRR基因在幼體各發(fā)育階段都有表達(dá)，在胚胎發(fā)育時(shí)期表達(dá)量較高，原腸胚時(shí)期和早期擔(dān)輪幼體時(shí)期達(dá)到最高，擔(dān)輪幼體時(shí)期表達(dá)量有所降低，從面盤幼體時(shí)期至圍口殼幼體時(shí)期，表達(dá)量顯著下降。IRR基因在成體各組織中均有表達(dá)，在精巢中表達(dá)量最高，在卵巢中表達(dá)量最低。整體原位雜交結(jié)果顯示，IRR基因從原腸胚時(shí)期開(kāi)始表達(dá)，擔(dān)輪幼體期，IRR基因在后毛輪區(qū)表達(dá)，面盤幼體早期，開(kāi)始在殼腺處表達(dá)，面盤

7、幼體中期，表達(dá)部位分布在內(nèi)臟團(tuán)和貝殼處，至面盤幼體后期，信號(hào)增強(qiáng)，主要集中于內(nèi)臟團(tuán)區(qū)，到達(dá)圍口殼幼體時(shí)期，IRR基因在消化腺表達(dá)量減少，并開(kāi)始在外套膜和足部表達(dá)。利用高通量測(cè)序手段在18個(gè)包含IRR外顯子的片段中共篩選獲得了17個(gè)與雜色鮑生長(zhǎng)性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn)。其中8個(gè)位點(diǎn)與所測(cè)的雜色鮑性狀均明顯相關(guān)，其余位點(diǎn)與一個(gè)或幾個(gè)生長(zhǎng)性狀相關(guān)聯(lián)。選擇與足肌重量和殼的生長(zhǎng)性狀均顯著相關(guān)的A2198T位點(diǎn)，分析IRR基因在該位點(diǎn)三種基因型的足肌和

8、外套膜中表達(dá)量的相互關(guān)系，發(fā)現(xiàn)足肌重量及殼長(zhǎng)、殼寬、殼高、殼重值最高的AA型個(gè)體中，IRR基因在足肌和外套膜中表達(dá)量最高，而生長(zhǎng)性狀平均值最低的TT型個(gè)體，IRR基因在足肌和外套膜中的表達(dá)量最低。進(jìn)一步驗(yàn)證了A2198T位點(diǎn)與雜色鮑生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性。
　　3、利用普通PCR技術(shù)及RACE技術(shù)獲得了FGFR基因的cDNA全長(zhǎng)序列及ORF區(qū)的部分基因組DNA序列。FGFR基因cDNA全長(zhǎng)5059 bp，ORF長(zhǎng)3729bp，ORF區(qū)基

9、因組DNA中的外顯子已全部獲得，共包含23個(gè)外顯子。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了FGFR在雜色鮑胚胎/幼體不同發(fā)育時(shí)期及成體不同組織的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)FGFR基因在所測(cè)的幼體/胚胎不同發(fā)育階段均有表達(dá)，在受精卵時(shí)期表達(dá)量較高，2細(xì)胞期開(kāi)始降低，至圍口殼幼體時(shí)期表達(dá)量又顯著升高。在雜色鮑成體各組織中，F(xiàn)GFR基因在鰓、外套膜、肝胰腺、足肌、精巢組織中均有表達(dá)，其中，鰓和外套膜中表達(dá)量最高，而在卵巢和血淋巴中幾乎不表達(dá)。利用高通量測(cè)序手段在24個(gè)