鹿茸尖端組織的EST分析及其生長相關(guān)功能基因的表達.pdf

1、鹿茸是哺乳動物中惟一失去后還能完全再生的器官,其驚人的生長速率也是哺乳動物任何組織和器官所無法比擬的。推測鹿茸的生長有它特殊的物質(zhì)基礎(chǔ),存在自身的規(guī)律。多年來,許多學(xué)者從各種角度、采用各種科學(xué)手段對這一特殊的、絕無僅有的動物學(xué)生命現(xiàn)象的內(nèi)在機制進行了研究,但迄今仍沒能從根本上闡明茸角生長的生物學(xué)調(diào)控機理。
　　 鹿茸的生長是在一個復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控下進行的,篩選出鹿茸生長相關(guān)的調(diào)控基因是研究鹿茸生長內(nèi)在機制的重要思路。本文以構(gòu)建

2、成功的鹿茸尖端組織全長cDNA文庫為材料,進行了5’端EST測序及分析,并在此基礎(chǔ)上結(jié)合生物信息學(xué)方法和實時熒光定量PCR技術(shù)對文庫中部分中、高豐度表達的生長相關(guān)基因進行了序列特征和表達的初步研究,結(jié)果如下:
　　 1.從鹿茸尖端組織cDNA質(zhì)粒文庫中隨機選取1012個克隆進行測序,經(jīng)Cross-match軟件編輯后,獲得長度大于100 bp的有效序列為906條,其序列的平均長度為390.48bp,GC含量為44.56％。利用P

3、hrap軟件對906條有效EST序列進行片段重疊群分析和拼接后共獲得701個獨立基因(Unigene),其中包括86個片段重疊群(Contig)和615個獨立的ESTs(Singlet)。GenBank登錄號:GH546162-GH546861和GH571843。
　　 2.經(jīng)BLASTX和BLASTN程序檢索和分析,具有已知或推測功能基因580個,未知功能基因74個,未比對上的基因47個(可能是新基因)。與歐洲牛同源的基因所占

4、比例最大,占81.3％。通過GeneOntology分類對獲得的已知功能基因進行了包括分子功能、生物過程和細(xì)胞組分在內(nèi)的三個層次的功能注釋,明確了各個層次的基因表達的整體情況,構(gòu)建了東北梅花鹿鹿茸尖端組織的基因表達譜,并根據(jù)BLAST注釋結(jié)果,通過進一步聚類分析,得到了42條與鹿茸尖端組織生長相關(guān)的功能基因。
　　 3.采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了在鹿茸研究中首次提到的7個生長相關(guān)功能基因的表達,并對其中5個經(jīng)重新測序測通的

5、具有全長cDNA的基因進行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明:
　　 ①骨唾液蛋白Ⅱ基因cDNA全長1576 bp,開放閱讀框長936 bp,編碼311個氨基酸。預(yù)測其編碼蛋白分子量為34.1KD,理論等電點pI為4.05。該基因含信號肽,為分泌蛋白,存在兩個跨膜區(qū),具有一個BSP-Ⅱ結(jié)構(gòu)域,亞細(xì)胞定位在胞外,二級結(jié)構(gòu)主要以a螺旋和無規(guī)則卷曲為主。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果表明:該基因在鹿茸皮膚層及間充質(zhì)層幾乎沒有表達,前軟骨層和軟骨層

6、均有表達,且軟骨層表達強度明顯高于前軟骨層,其表達與鹿茸組織礦化的過程呈顯著正相關(guān)。提示該基因作為骨基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)蛋白,參與鹿茸組織礦化。
　　 ②骨橋蛋白基因cDNA全長1406bp,開放閱讀框長840bp,編碼279個氨基酸。預(yù)測其編碼蛋白分子量為30.99KD,理論等電點pI為4.40。該基因含信號肽,為分泌蛋白,存在兩個跨膜區(qū),具有一個Osteopontin結(jié)構(gòu)域,亞細(xì)胞定位在胞外,二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主。實時熒光定量

7、PCR檢測結(jié)果表明:該基因的表達具有波動性,其表達量從鹿茸皮膚層到前軟骨層逐漸上升,到軟骨層表達量又下調(diào)。推測該基因通過介導(dǎo)破骨細(xì)胞與礦化組織的黏附,參與了鹿茸組織礦化。
　　 ③核心蛋白多糖基因cDNA全長1831 bp,開放閱讀框長1083bp,編碼360個氨基酸。預(yù)測其編碼蛋白分子量為39.9KD,理論等電點pI為8.8。該基因含有信號肽,為分泌蛋白,存在三個跨膜區(qū)和兩個LRR-RI結(jié)構(gòu)域,亞細(xì)胞定位在胞質(zhì)內(nèi)外,二級結(jié)構(gòu)中

8、a螺旋和無規(guī)則卷曲居多。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果表明:該基因在鹿茸間充質(zhì)層的表達顯著高于其他三層組織。提示該基因的抗纖維化活性可能是維持鹿茸間充質(zhì)層快速生長的另一個重要調(diào)節(jié)因素。
　　 ④鈣調(diào)節(jié)素基因cDNA全長1527 bp,開放閱讀框長462bp,編碼149個氨基酸。預(yù)測其編碼蛋白分子量為16.9 KD,理論等電點pI為4.09。該基因無跨膜區(qū)和信號肽,為非分泌蛋白,存在兩個Efh結(jié)構(gòu)域,亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核與線粒體,二級結(jié)

9、構(gòu)主要以a螺旋為主。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果表明:該基因在鹿茸皮膚層的表達量顯著高于其他三種組織,可見該基因的高表達對促進茸皮組織生長具有積極地作用。
　　 ⑤膜聯(lián)蛋白基因cDNA全長1487bp,開放閱讀框長1050bp,編碼349個氨基酸。預(yù)測其編碼蛋白分子量為39.5KD,理論等電點pI為6.92。該基因沒有跨膜區(qū)和信號肽,為非分泌性蛋白,存在四個ANX結(jié)構(gòu)域,亞細(xì)胞定位在核內(nèi),二級結(jié)構(gòu)主要以a螺旋為主。實時熒光定量PC

10、R檢測結(jié)果表明:該基因在鹿茸皮肽層和間充質(zhì)層表達量低,而在前軟骨層至軟骨層卻維持著高表達。推測該基因通過參與鹿茸組織Ca2+離子通道形成,從而參與了鹿茸組織礦化。
　　 ⑥纖連蛋白1基因經(jīng)實時熒光定量PCR檢測顯示:該基因的表達量從鹿茸皮膚層到軟骨層逐漸上升,且前軟骨層和軟骨層的表達量明顯高于皮膚層和間充質(zhì)層,推測該基因可通過直接刺激成骨細(xì)胞的生長分化和增殖,參與成骨過程。
　　 ⑦骨結(jié)合素經(jīng)實時熒光定量PCR檢測顯示,

11、其表達方式與骨橋蛋白相似,二者相比骨結(jié)合素在前軟骨層表現(xiàn)出更明顯的高表達,推測該基因?qū)拥V化過程,促使礦物質(zhì)在膠原上沉積起著重要作用。
　　 綜合分析表明,骨唾液蛋白Ⅱ、骨橋蛋白、膜聯(lián)蛋白、纖連蛋白1及骨結(jié)合素在鹿茸尖端組織中的表達方式較為相似,即在鹿茸皮膚層和間充質(zhì)層表達量低,而在前軟骨層至軟骨層卻維持著較高的表達水平,推測它們可能作為重要的骨化因子共同促進了鹿茸角組織的成骨過程;而鈣調(diào)節(jié)素、核心蛋白多糖則可能是鹿茸皮膚層和