腎細(xì)胞癌中AEG-1的表達(dá)及其與侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系研究.pdf

1、腎細(xì)胞癌(reanl cell carcinoma,RCC)是來源于腎小管上皮細(xì)胞的成人泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，在泌尿系統(tǒng)的惡性腫瘤中發(fā)病率僅次于前列腺癌和膀胱的尿路上皮癌而位列第三，約占所有腫瘤的3％左右。近年來，腎細(xì)胞癌發(fā)病率有上升的趨勢(shì)。局限性腎細(xì)胞癌患者通過根治性手術(shù)可獲得根治。但由于腎細(xì)胞癌早期癥狀常不明顯，患者出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)往往已經(jīng)進(jìn)入局部進(jìn)展期或晚期。大約一半左右的腎細(xì)胞癌患者在病程中會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)移性的腎細(xì)胞癌對(duì)

2、傳統(tǒng)的化療和放療均不敏感，目前仍無(wú)有效的治療手段，預(yù)后極差。雖然目前對(duì)腎癌的免疫治療和靶向藥物治療已經(jīng)取得一定的進(jìn)展，一定程度上改善了患者的預(yù)后，但這些治療抗腫瘤的持續(xù)效應(yīng)差，且副作用大，因此迫切需要進(jìn)一步研究以明確腎細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)分子機(jī)制，尋找有效的防治手段以進(jìn)一步提高腎細(xì)胞癌治療效果。AEG-1(astrocyte elevated gene-1)是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)基因，具有類似癌基因樣作用。已經(jīng)在人體腫瘤包括肺、乳腺、肝臟、

3、前列腺等一系列腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)表達(dá)顯著升高，并且其表達(dá)水平和腫瘤的進(jìn)展存在相關(guān)性。體外研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控AEG-1基因的表達(dá)可影響多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、侵襲、凋亡等改變，體內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)AEG-1基因的上調(diào)與腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和侵襲之間有關(guān)。但有關(guān)AEG-1在腎細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，目前尚無(wú)相關(guān)的研究。
　　 本研究首先應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR、Westernblot、免疫組織化學(xué)、免疫熒光等方法檢測(cè)8例配對(duì)的散發(fā)性腎細(xì)胞

4、癌新鮮組織和癌旁組織的AEG-1mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，同時(shí)檢測(cè)了四種腎細(xì)胞癌細(xì)胞株的AEG-1mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，明確了AEG-1在腎細(xì)胞癌組織和細(xì)胞株中均存在顯著上調(diào)，隨后我們通過對(duì)102例患者AEG-1表達(dá)的半定量和臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析初步探討了AEG-1基因與腎細(xì)胞癌進(jìn)展及與患者預(yù)后的關(guān)系；并進(jìn)一步分析了AEG-1表達(dá)水平與E-cad及微血管密度的相關(guān)性，探討 AEG-1表達(dá)水平在腎細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移中可能的作用

5、。最后，我們構(gòu)建pcDNA-AEG-1重組質(zhì)粒并設(shè)計(jì)了SiRNA片段分別上調(diào)和下調(diào)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株786-0的AEG-1基因的表達(dá)，研究上調(diào)及下調(diào)AEG-1基因分別對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞侵襲力、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等的影響，為AEG-1作為細(xì)胞腎癌治療新的靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究分為三個(gè)部分：
　　 第一部分：AEG-1在腎細(xì)胞癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)。
　　 目的：檢測(cè)正常腎組織、腎細(xì)胞癌組織及腎細(xì)胞癌細(xì)胞株中AEG-1的mR

6、NA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，探討AEG-1在腎細(xì)胞癌的發(fā)生中的作用。
　　 方法：運(yùn)用real-time PCR和Western blot的方法檢測(cè)8例配對(duì)的腎細(xì)胞癌組織和癌旁正常腎組織及4種腎細(xì)胞癌細(xì)胞株與正常腎小管上皮細(xì)胞的AEG-1的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：⑴AEG-1在正常腎組織主要表達(dá)于腎小管，且主要位于遠(yuǎn)端腎小管和集合管；表達(dá)的部位在正常腎小管細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞均位于細(xì)胞漿，未見胞核表達(dá)。⑵Wester

7、n blot和real-time PCR顯示AEG-1的mRNA和蛋白水平在腎細(xì)胞癌組織的表達(dá)較同一患者癌旁組織顯著升高，升高幅度為2-38倍；石蠟組織的免疫組化顯示AEG-1蛋白表達(dá)的結(jié)果與Western blot和實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果一致。⑶四種腎細(xì)胞癌細(xì)胞株中AEG-1的mRNA和蛋白水平較人正常腎小管上皮細(xì)胞HK-2顯著升高，升高幅度為2-12倍，其中轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌細(xì)胞株Caki-1的表達(dá)水平最高。細(xì)胞免疫熒光的結(jié)果與Weste

8、rn blot和實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果一致。
　　 結(jié)論：我們的研究結(jié)果證實(shí)AEG-1蛋白在腎細(xì)胞癌細(xì)胞和組織均較其相應(yīng)的正常組織和細(xì)胞存在顯著上調(diào)，AEG-1可能在腎細(xì)胞癌的發(fā)生及發(fā)展過程中起一定作用。
　　 第二部分：AEG-1的表達(dá)水平與腎細(xì)胞癌進(jìn)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　 目的：研究腎細(xì)胞癌組織中AEG-1的表達(dá)水平與腎細(xì)胞癌的病理學(xué)指標(biāo)及臨床分期、患者的生存時(shí)間之間的關(guān)系。并通過分析AEG-1的表達(dá)水平與E-

9、cadherin及微血管密度MVD之間的關(guān)系，探討AEG-1在腎細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移中的可能作用。
　　 方法：用免疫組化的方法半定量分析102例腎細(xì)胞癌患者的AEG-1蛋白表達(dá)，并分析AEG-1蛋白表達(dá)的水平與腎細(xì)胞癌的病理學(xué)指標(biāo)及臨床分期、患者的生存時(shí)間之間的關(guān)系。同時(shí)檢測(cè)39例腎透明細(xì)胞癌組織中E-cadherin水平，免疫組化CD31標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞并計(jì)算微血管密度(mierovesseldensity，MVD)，分析AEG-1蛋白的

10、表達(dá)水平與E-cadherin和MVD之間的相關(guān)關(guān)系。
　　 結(jié)果：⑴102例腎細(xì)胞癌組織中96例患者(94.1％)可檢測(cè)到AEG-1蛋白的上調(diào)，透明細(xì)胞癌、乳頭狀腎細(xì)胞癌、嫌色細(xì)胞癌和集合管癌四種組織學(xué)類型的腎細(xì)胞癌均可見AEG-1蛋白表達(dá)的顯著上調(diào)。⑵86例透明細(xì)胞癌和10例乳頭狀癌患者AEG-1表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示AEG-1的表達(dá)水平與腎細(xì)胞癌的核級(jí)呈顯著正相關(guān)(P＜0.001)，并且與患者的臨床分期(P=0.003)

11、、腫瘤的大小(P=0.003)及轉(zhuǎn)移(P=0.032)相關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)顯著相關(guān)性(P=0.457)。⑶AEG-1高表達(dá)組患者的5年累積生存率僅為52.4％，顯著低于AEG-1低表達(dá)組的91.3％(P=0.002)，提示AEG-1表達(dá)高的患者預(yù)后差。⑷E-cadherin在腎細(xì)胞癌的表達(dá)水平顯著下調(diào)，約50％的腎細(xì)胞癌不表達(dá)E-cadherin，其表達(dá)水平與腎細(xì)胞癌的分級(jí)、臨床分期及轉(zhuǎn)移無(wú)顯著相關(guān)性，與其AEG-1的表達(dá)水平無(wú)相關(guān)性。

12、⑸MVD在不同核級(jí)腎細(xì)胞癌之間存在顯著性差異，隨著核級(jí)的增加，MVD隨之增加，并與AEG-1蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)(P=0.010，r=0.455)。
　　 結(jié)論：AEG-1蛋白在各種組織學(xué)類型的腎細(xì)胞癌均存在上調(diào)表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)；AEG-1蛋白高表達(dá)提示預(yù)后較差；AEG-1蛋白與E-cadherin蛋白的表達(dá)水平無(wú)相關(guān)關(guān)系，而AEG-1的表達(dá)與MVD呈顯著正相關(guān)，提示AEG-1蛋白的高表達(dá)可能通過影響腫瘤

13、的微血管生成來促進(jìn)腎細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移。
　　 第三部分：下調(diào)及上調(diào)AEG-1基因?qū)δI透明細(xì)胞癌細(xì)胞株786-0的影響。
　　 目的：研究下調(diào)及上調(diào)AEG-1基因?qū)ν该骷?xì)胞癌細(xì)胞株786-0體外生長(zhǎng)、侵襲能力和血管生成的影響，探討以AEG-1作為靶點(diǎn)治療腎細(xì)胞癌的可能性。
　　 方法：①設(shè)計(jì)和合成可抑制AEG-1表達(dá)的siRNA，并轉(zhuǎn)染進(jìn)入786-0細(xì)胞中。利用real-timePCR和western blot方法檢測(cè)

14、AEG-1mRNA和蛋白表達(dá)情況，篩選出一條抑制效率最高的AEG-1-SiRNA。②利用pMD18-T載體克隆AEG-1開放讀碼框，經(jīng)測(cè)序鑒定后，構(gòu)建PCDNA/AEG-1重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染入786-0細(xì)胞，G418篩選出高表達(dá)AEG-1的細(xì)胞。③成功上調(diào)和下調(diào)AEG-1基因的表達(dá)后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況；Matrigel膠侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腎細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲能力；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腎細(xì)胞癌細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況；明膠酶譜法測(cè)MMP-2、MMP-9

15、的活性；與HUVEC共培養(yǎng)觀察對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)形成的影響。
　　 結(jié)果：⑴兩條siRNA片段均可顯著抑制AEG-1基因的表達(dá)，干擾的效果分別達(dá)到79％和75％，與空白對(duì)照組間有顯著性差異。⑵AEG-1 siRNA干擾786-0細(xì)胞后，與空白組和陰性對(duì)照組相比，MTT顯示AEG-1siRNA干擾組786-0細(xì)胞生長(zhǎng)減慢(P＜0.05)；Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)法顯示AEG-1siRNA干擾組細(xì)胞侵襲能力下降；流式細(xì)胞術(shù)分析表明與