胃癌淋巴道轉(zhuǎn)移相關基因的篩選暨AEG-1與胃癌預后關系的研究.pdf

1、第一章胃癌淋巴道轉(zhuǎn)移相關基因的篩選
　　 目的：
　　 篩選胃癌淋巴道轉(zhuǎn)移相關基因，并對興趣基因進行驗證，探討胃癌淋巴道轉(zhuǎn)移的機制；并研究淋巴管來源的CXCL1在胃癌淋巴道轉(zhuǎn)移中的作用。
　　 方法：
　　 胃癌SGC7901(5×106)細胞注射于裸大鼠爪墊，建立胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移動物模型。移植瘤周圍注射Evan's藍，顯示胭窩淋巴結(jié)(前哨淋巴結(jié))和其輸入淋巴管。分離前哨淋巴結(jié)的輸入淋巴管。原代培養(yǎng)淋巴管內(nèi)

2、皮細胞，采用間接法磁珠分選，流式細胞學檢測分離的細胞純度，免疫組織化學(VEGFR-3、LYVE-1、podoplanin)鑒定細胞。胭窩淋巴結(jié)連續(xù)切片，HE(hematoxylin and eosin)染色確定是否腫瘤轉(zhuǎn)移。收集胃癌細胞轉(zhuǎn)移到前哨淋巴結(jié)后培養(yǎng)的輸入淋巴管內(nèi)皮細胞，Agilent基因表達譜芯片篩選與對照淋巴管內(nèi)皮細胞的差異表達基因。利用軟件篩選差異表達基因，RT-PCR方法對基因芯片的有關差異基因進行驗證。
　　

3、 我們挑選上調(diào)表達的CXCL1作為興趣基因。觀察CXCL1對SGC7901細胞的趨化作用，研究CXCL1的受體CXCR2在SGC7901細胞和125例胃癌組織中的表達情況，分析CXCR2的表達與臨床病理參數(shù)和淋巴管密度(lymphatic vesselsdensity，LVD)之間的關系。體外建立淋巴管內(nèi)皮細胞和SGC7901細胞的共培養(yǎng)體系，觀察淋巴管內(nèi)皮細胞CXCL1的表達情況和調(diào)節(jié)的機制。研究共培養(yǎng)后淋巴管內(nèi)皮細胞遷移和小管形成能

4、力的變化，并觀察CXCL1siRNA及CXCR2受體阻斷劑SB225002對共培養(yǎng)內(nèi)皮細胞的遷移和小管形成能力的影響，并分析參與分子的表達變化。
　　 結(jié)果：
　　 胃癌爪墊裸大鼠移植瘤成功。原位瘤早期(2周)顯微手術成功分離前哨淋巴結(jié)的輸入淋巴管。貼壁培養(yǎng)的淋巴管周圍爬出上皮樣細胞，間接法磁珠分選LYVE+的細胞，流式細胞學證實分選的LYVE+細胞比例95％以上。LYVE-1、podoplanin、VGFR-3免疫細胞

5、化學染色結(jié)果顯示所培養(yǎng)的為淋巴管內(nèi)皮細胞。Agilent芯片雜交結(jié)果熒光信號強度較一致，實驗體系穩(wěn)定，芯片平均檢出率(即有表達的基因)70.74％。根據(jù)差異倍數(shù)大于2并且具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)篩選了846個差異表達的基因，其中457個上調(diào)，389個下調(diào)。RT-PCR檢測Timp2、EphrinB1、FoxC2、Igfbp3、SMAD7、CXCL1、Oldlr1、Agt和Lrp3基因表達趨勢，和芯片結(jié)果符合。根據(jù)內(nèi)皮細胞的功能以及

6、潛在與淋巴管新生和腫瘤轉(zhuǎn)移的關系，挑選了一系列相關的基因：趨化和生長因子、脈管發(fā)生和模式、脈管壓力、細胞粘附和類固醇合成等。包含至少四個差異基因且具有統(tǒng)計學意義的信號通路包括：過氧化物酶增殖體激活受體、鈣信號轉(zhuǎn)導途徑、細胞因子和受體作用、補體與凝集的級聯(lián)反應、細胞外基質(zhì)受體以及細胞間隙連接、Wnt信號途徑、黏著斑激酶信號途徑、類固醇合成途徑、ABC轉(zhuǎn)運蛋白、胰島素信號途徑。
　　 芯片結(jié)果提示CXCL1基因上調(diào)表達3.3倍，RT

7、-PCR結(jié)果提示升高6.2倍。我們發(fā)現(xiàn)CXCL1因子對SGC7901細胞有趨化作用。CXCL1受體CXCR2在SGC7901細胞上呈陽性表達，而在125例胃癌組織中，其中80例CXCR2呈陽性表達。其表達與腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠期轉(zhuǎn)移有關。此外CXCR2的表達與LVD相關。體外建立共培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)淋巴管內(nèi)皮細胞的CXCL1表達上調(diào)，而且CXCL1表達上調(diào)與NF-κBp65的核轉(zhuǎn)位有關。CXCL1表達上調(diào)后淋巴管內(nèi)皮細胞遷移和小管

8、形成能力增強。CXCL1siRNA及CXCR2受體阻斷劑SB225002可以阻斷這種變化。CXCL1表達上調(diào)導致的淋巴管內(nèi)皮細胞遷移和小管形成能力增強與p-FAK(Tyr-397)、p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)、p-Rho A(Ser-188)蛋白表達上調(diào)相關，CXCL1siRNA及CXCR2受體阻斷劑SB225002可以下調(diào)共培養(yǎng)的LECs的p-FAK(Tyr-397)、p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)

9、、p-Rho A(Ser-188)蛋白的表達。
　　 結(jié)論：
　　 成功構(gòu)建了前哨淋巴結(jié)的輸入淋巴管內(nèi)皮細胞在腫瘤轉(zhuǎn)移后的差異基因表達譜。篩選了一系列與淋巴管內(nèi)皮細胞的功能和淋巴管新生及腫瘤轉(zhuǎn)移的相關的基因和信號通路。
　　 CXCL1/CXCR2在胃癌淋巴管新生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中起重要作用。CXCL1促進胃癌細胞遷移，其受體CXCR2在胃癌組織中表達與LVD密切相關。淋巴管來源的CXCL1在促進腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮

10、重要作用。
　　 第二章 AEG-1與胃癌預后關系的研究
　　 目的：
　　 研究星形細胞上調(diào)基因-1(astrocyte elevated gene-1，AEG-1)在胃癌組織中的表達情況，分析其與預后的關系；探討AEG-1對胃癌細胞生長、凋亡及遷移、侵襲的影響及其機制；初步探討抑制AEG-1表達胃癌細胞對5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)的敏感性的分子機制。
　　 方法：
　　 We

11、stern blot檢測AEG-1在胃癌細胞(AGS，SGC7901，MGC803，MKN28和MKN45)中的表達。免疫組織化學檢測105例胃癌組織及其中對應30例癌旁組織AEG-1的表達情況。結(jié)合臨床和隨訪資料，分析其與臨床病理參數(shù)之間的關系。生存分析采用Kaplan-Meier法。單因素采用x2檢驗，多因素分析采用Cox回歸模型。
　　 采用RT-PCR方法篩選特異抑制AEG-1表達的siRNA，Western blot檢

12、測其抑制效果。觀察AEG-1下調(diào)后對胃癌SGC7901生物學行為的影響。MTT檢測生長，流式細胞學檢測細胞凋亡，Transwell小室觀察細胞的遷移和侵襲。Westernbolt檢測AEG-1下調(diào)后胃癌Wnt/β-catenin信號通路蛋白的表達。觀察Wnt信號通路激活劑氯化鋰對AEG-1 siRNA處理后β-catenin表達的影響。
　　 觀察AEG-1 siRNA對SGC7901細胞5-Fu的耐藥曲線和半數(shù)抑制濃度(IC5

13、0)的影響，RT-PCR檢測胃癌細胞AEG-1siRNA處理后5-Fu代謝的關鍵酶-二氫嘧啶脫氫酶(dihydropyrimidine dehydrogenase，DPD)的表達變化。
　　 結(jié)果：
　　 AEG-1在五種胃癌細胞中均有表達，其中在低分化的胃腺癌細胞株(SGC7901和MKN45)中的表達高于在高分化或者中等分化的癌細胞株的表達(AGS、MGC803和MKN28)。在我們105例病人標本中，66例(62.

14、9％)胃癌組織呈陽性表達。AEG-1的表達與胃癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移以及TNM分期明顯相關(P值分別為0.000，0.004，0.026和0.000)。AEG-1的表達與Ki-67增殖指數(shù)相關。生存曲線分析發(fā)現(xiàn)AEG-1過表達與胃癌預后明顯相關，AEG-1高表達的患者的五年的生存率為28.78％，中位生存期為23個月，而AEG-1表達陰性的生存率為61.5％，中位生存期為38個月，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。單因素分

15、析其他因子T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移以及TNM分期與胃癌的預后相關。Cox模型中發(fā)現(xiàn)，TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和AEG-1過表達是胃癌獨立的預后因素。
　　 si-002對AEG-1表達的抑制效應最強。AEG-1下調(diào)可以抑制胃癌SGC7901細胞的生長，胃癌細胞的早期凋亡比例增加。AEG-1siRNA處理細胞能明顯抑制胃癌細胞的遷移和侵襲。AEG-1siRNA能下調(diào)p-AKT(S473)、p-GSK3β(S9)、β-cateni

16、n、Lef-1和cyclinD1的表達。AEG-1siRNA明顯抑制氯化鋰刺激的β-catenin的表達。
　　 轉(zhuǎn)染 AEG-1 siRNA的SGC7901細胞與未轉(zhuǎn)染的細胞及僅轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的細胞相比，細胞耐藥性明顯降低，IC50值明顯下降(P＜0.05)。SGC7901細胞表達一定量的DPDmRNA，而且經(jīng)5-Fu處理后，表達水平升高。AEG-1 siRNA可以下調(diào)DPDmRNA的表達。
　　 結(jié)論：