延邊株氣腫疽梭菌的分離鑒定及cctA基因的克隆和表達(dá).pdf

1、氣腫疽是由氣腫疽梭菌引起的一種急性、熱性、敗血性傳染病，因其具有發(fā)病快、死亡率高的特點(diǎn)，給畜牧業(yè)的發(fā)展帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病主要以皮下和深部肌肉處發(fā)生氣性、炎性腫脹，按壓有捻發(fā)音為典型特征。而繼2006年之后吉林省延邊州敦化市、延吉市依蘭鎮(zhèn)、三道鎮(zhèn)相繼出現(xiàn)牛氣腫疽病例，這嚴(yán)重制約了延邊州乃至全國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展。隨著其易感群體的逐漸擴(kuò)大，氣腫疽梭菌也越來(lái)越多的威脅到了人類(lèi)的安全。
　　為了制備安全高效的新型氣腫疽疫苗，控制本地區(qū)氣

2、腫疽病的發(fā)生，本研究對(duì)延邊州延吉市采集的疑似氣腫疽梭菌感染的牛肝臟、脾臟、肌肉等組織進(jìn)行了分離，應(yīng)用病原學(xué)檢查、生化鑒定、動(dòng)物試驗(yàn)及分子生物學(xué)鑒定的方法對(duì)該菌進(jìn)行了鑒定。根據(jù)GenBank中已發(fā)表的氣腫疽梭菌cctA基因，設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物，并以分離純化的延邊株氣腫疽梭菌總DNA為模板擴(kuò)增出cctA基因，并進(jìn)行克隆載體的構(gòu)建。利用生物信息學(xué)方法，對(duì)cctA蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)功能域、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)及抗原表位等重要參數(shù)進(jìn)行了

3、預(yù)測(cè)和分析。將克隆質(zhì)粒pMD19-T-cctA進(jìn)行雙酶切后，與pEGX-4T-1原核表達(dá)載體進(jìn)行連接，構(gòu)建 pGEX-4T-cctA原核表達(dá)重組質(zhì)粒，并對(duì)其陽(yáng)性克隆誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析。
　　研究結(jié)果表明：本試驗(yàn)成功的對(duì)延邊株氣腫疽梭菌進(jìn)行了分離，與參考序列（JQ692583）相比，共存在5處突變，核苷酸和氨基酸序列的同源性均為99.0％；該蛋白的理論等電點(diǎn)為6.79，不存在跨膜區(qū)和信號(hào)肽序