PDGF和MMPs在大鼠頸動-靜脈分流肺高壓模型肺血管重構(gòu)中的作用及藥物的干預(yù)研究.pdf

1、我國先天性心臟病發(fā)病率高達(dá)0.8％，其中左向右分流先心病占絕大數(shù)，在先天性心臟病的治療中，肺動脈高壓是影響預(yù)后的主要因素。肺血管重構(gòu)是肺動脈高壓病程中極為重要的環(huán)節(jié)，近年來，針對肺血管重構(gòu)機(jī)制的研究已成為肺動脈高壓研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，在缺氧和野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓模型中的研究表明，血小板源性生長因子(PDGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在肺血管重構(gòu)發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用，但在先天性心臟病肺動脈高壓中的意義尚未明確。 探索針

2、對肺血管重構(gòu)的治療措施，一直是肺動脈高壓治療的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。在動物實(shí)驗(yàn)研究中，它汀類藥物表現(xiàn)出來對動脈粥樣硬化血管重構(gòu)的抑制作用，使這類降脂藥在肺高壓肺血管重構(gòu)中的潛在治療價值備受關(guān)注，已經(jīng)有研究顯示，它汀類可以降低低氧和野百合堿模型肺動脈的阻力，抑制甚至逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)現(xiàn)象，然而，它汀類對分流型肺高壓是否有治療作用，尚未明確。 本研究通過頸動-靜脈分流手術(shù)，建立大鼠的左向右分流肺動脈高壓模型，研究血小板源性生長因子(PDGF-A、

3、PDGF-B，以及PDGFR-α、PDGFR-β)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-1、MMP-9)活性變化在肺血管重構(gòu)中的作用：同時研究它汀類藥物辛伐他汀、抗血小板藥物氯吡格雷以及前列環(huán)素類藥物貝前列素納對肺血管重構(gòu)的治療效果及可能機(jī)制，初步探索針對左向右分流型肺高壓血管重構(gòu)現(xiàn)象的藥物治療方法。 第一部分PDGF與MMPs在大鼠頸動-靜脈分流肺高壓肺血管重構(gòu)中的作用研究 目的:建立大鼠頸動-靜脈分流模型，觀察肺血管重構(gòu)的情況，

4、研究肺組織血小板衍生因子PDGF-A、PDGF-B、PDGFR-α、PDGFR-β以及MMP-1、MMP-2在肺血管重構(gòu)行程中表達(dá)水平的變化. 材料與方法:SD大鼠36只，隨機(jī)分為三組。隨機(jī)分3組：假手術(shù)組(Sham，N=12)，手術(shù)分流組(CA-JV，N=12)，野百合堿注射肺高壓對照組(MCT，N=12)。Sham組：進(jìn)行假手術(shù)，切除胸鎖乳突肌，結(jié)扎左側(cè)頸動脈和頸靜脈。MCT組：野百合堿60mg/Kg單次右側(cè)皮下注射。CA-

5、JV組：通過套管法建立左側(cè)頸動-靜脈分流，Sham組、CA-JV組喂養(yǎng)12周，MCT組喂養(yǎng)6周，然后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定：1)右心室收縮壓測定；2)肺血管病理分析-MASSON三色染色；肺小動脈血管壁面積指數(shù)和厚度指數(shù)測定；3)肺組織PDGF-A，PDGF-B，PDGFR-α、PDGFR-β，MMP-1，MMP-9轉(zhuǎn)錄和翻澤水平的檢測(分別采用RT-PCR和Western-blotting檢測分析技術(shù)) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:一、頸動-靜脈分流

6、模型右心室收縮壓(RVSP)變化和Sham組比較，CA-JV組和MCT組右心室收縮壓明顯升高，(37.7±3.00vs25.42±2.07，P<0.001:44.00±4.60vs25.42±2.07，P<0.001)。 二、頸-靜脈分流模型肺血管重構(gòu)情況 1、肺組織MASSON三色染色光鏡結(jié)果Sham組肺血管組織學(xué)表現(xiàn)正常，CA-JV組出現(xiàn)類似于MCT組的肺血管重構(gòu)表現(xiàn)，肺小動脈管壁明顯增厚，管腔狹窄，血管中膜和內(nèi)膜增

7、厚、管壁膠原纖維成分含量明顯增多，血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤。 2、頸-靜脈分流模型肺血管重構(gòu)指數(shù)和Sham組比較，CA-JV，組和MCT組管壁面積指數(shù)(AI)明顯升高(0.6527±0.19116vs0.2326±0.10586，P<0.001：0.6394±0.14838vs0.2326±0.10586，P<0.001)。CA-JV組與MCT組間AI均值接近(0.6394±0.14838vs0.6527±0.19116，P=0.9

8、18)，肺小血管管壁厚度指數(shù)(TI)趨勢與AI一致，CA-JV組和MCT組TI均值高于Sham組(0.4336±0.16353vs0.1264±0.06508，P<0.001；0.4139±0.13135vs0.1264±0.06508，P<0.001)。CA-JV組和MCT組兩者的厚度指數(shù)高度接近。 三、各組肺組織PDGF、MMPsmRNA轉(zhuǎn)錄水平1、各組腫組織PDGFmRNA的轉(zhuǎn)錄水平和Sham組比較，CA-JV組、MCT組

9、肺組織PDGF-A、PDGF-B、PDGFR-α、PDGFR-β、mRNA的轉(zhuǎn)錄水平都升高(P<0.05)。MCT組PDGF-A及PDGFR-β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平高于CA-JV組(P<0.05)。 2、各組肺組織MMPsmRNA的轉(zhuǎn)錄水平和Sham組比較，CA-JV組、MCT組肺組織MMP-1和MMP-9的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平都升高(P<0.05)。CA-JV組MMP-1和MMP-9mRNA的轉(zhuǎn)錄水平高于MCT組(P<0.05)。

10、 四、各組肺組織PDGF，MMPs蛋白的表達(dá)1、各組肺組織PDGF蛋白水平的表達(dá)和Sham組比較，CA-JV組、MCT組肺組織PDGF-A和PDGF-B兩種配體以及PDGFR-α和PDGFR-β兩種受體的蛋白表達(dá)水平都升高(P<0.05)。MCT組PDGF-A蛋白表達(dá)水平高于分流組(P<0.05)，但CA-JV組PDGFR-α受體的蛋白表達(dá)水平高于MCT組(P<0.05)。 2、各組肺組織MMPs蛋白水平的表達(dá)。

11、 和Sham組比較，CA-JV組、MCT組肺組織MMP-1和MMP-9的蛋白表達(dá)水平都升高(P<0.05)。 結(jié)論: 1、套管法進(jìn)行頸動-靜脈分流，12周后大鼠出現(xiàn)肺動脈高壓表現(xiàn)，肺小動脈血管重構(gòu)現(xiàn)象明顯，適合作為左向右分流肺動脈高壓的研究模型。 2、PDGF-A，PDGF-B，PDGFR-α，PDGFR-β在兩種不同模型中，伴隨著肺血管重構(gòu)，表達(dá)均明顯升高，提示PDGF活性的改變可能參與了肺高壓中肺血管重構(gòu)的機(jī)

12、制。 3、MMP-1，MMP-9在兩種不同模型中，伴隨著肺血管重構(gòu)，表達(dá)均明顯升高，提示MMP-1，MMP-9活性的改變可能參與了肺高壓中肺血管重構(gòu)的機(jī)制。 第二部分藥物干預(yù)對大鼠頸動-靜脈分流肺高壓模型肺血管重構(gòu)的影響研究 目的:研究它汀類藥物辛伐他汀、前列環(huán)素類藥物貝前列素納以及抗血小板藥物氯吡格雷對肺血管重構(gòu)的治療效果以及對PDGF、MMPs表達(dá)水平的影響，初步探索針對左向右分流型肺高壓血管重構(gòu)現(xiàn)象的藥物治

13、療方法。 材料與方法: 60只清潔級的雄性SD大鼠，12周齡，體重250～300g，隨機(jī)分5組：假手術(shù)組(Sham，N=12)，手術(shù)分流對照組(CA-IV，N=12)；辛伐他汀組(SVT，N=12)，貝前列環(huán)素組(BPS，N=12)，氯吡格雷組(CPG，N=12)。Sham組接受假手術(shù)，其余各組采用套管法頸動-靜脈分流手術(shù)建立肺高壓模型。服藥及劑量：SVT組組：辛伐他汀4mg/kg/d；BPS組：貝前列素納片100μg/

14、kg/d；CPG組：氯吡格雷10mg/kg/d。相關(guān)藥物和生理鹽水約2-3ml，制成混懸液，每日專人經(jīng)食道灌胃，術(shù)后第二天開始給藥。喂養(yǎng)12周后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定：1)肺血管病理分析-MASSON三色染色；2)肺小動脈血管壁面積指數(shù)和厚度指數(shù)測定；3)肺組織PDGF-A，PDGF-B，PDGFR-α，PDGFR-β，MMP-1，MMP-9轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的檢測(分別采用RT-PCR和Western-blotting檢測分析技術(shù))。

15、實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 一、肺血管重構(gòu)現(xiàn)象1、光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果與Sham組比較，CA-IV、SVT、BPS、CPG組均出現(xiàn)不同程度的肺小血管重構(gòu)現(xiàn)象，肺小動脈管壁增厚，管腔狹窄，血管壁成分增加，表現(xiàn)為內(nèi)膜增厚，平滑肌細(xì)胞肥厚、增生，管壁膠原纖維染色增多，直徑小于50μm非肌型動脈形成新肌層化。血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤。 2、肺血管重構(gòu)指數(shù)測定結(jié)果SVT、BPS、CPG組AI均值都高于Sham組(0.5378±0.1637vs0.232

16、6±0.10586，P<0.05；0.4896±0.1738vs0.2326±0.10586，P<0.05:0.6247±0.1578vs0.2326±0.10586，P<0.05)。SVT組和BPS糾AI值小于CA-JV組(0.5378±0.1637VS0.6527±0.1912，P<0.05:0.4896±0.1738vs0.6527±0.1912，P<0.05)。 各組的肺小血管管壁厚度指數(shù)(TI)趨勢與AI一致。

17、 二、各組肺組織PDGF、MMPsmRNA轉(zhuǎn)錄水平. 三、各組肺組織PDGF，MMPs蛋白的表達(dá). 結(jié)論: 1、辛伐他汀及貝前列環(huán)素干預(yù)可減輕頸動-靜脈分流模型大鼠肺血管重構(gòu)的程度，氯吡格雷干預(yù)不能減輕肺血管重構(gòu)程度。 2、辛伐他汀抑制肺血管重構(gòu)的機(jī)制可能與以下因素有關(guān)。 2.1抑制肺組織MMP-9、MMP-1的活性。 2.2抑制肺組織PDGFR-βmRNA的轉(zhuǎn)錄。 3、貝前列環(huán)素