小麥木聚糖酶抑制蛋白的純化及TLXI基因的克隆與表達.pdf

1、由于木聚糖酶能將木聚糖降解成低聚木糖，其在造紙、食品、飼料等行業(yè)中顯示了廣闊的應(yīng)用前景。然而很多谷物中存在木聚糖酶抑制蛋白，這種蛋白能阻礙木聚糖酶活性的充分發(fā)揮從而降低木聚糖酶的應(yīng)用效率。本實驗用親和吸附的方法提取小麥籽粒中的木聚糖酶抑制蛋白，并從小麥品種鄭麥9023幼胚中克隆得到木聚糖酶抑制蛋白基因tlxi，并將其在畢赤酵母和大腸桿菌表達系統(tǒng)中進行表達。結(jié)果如下：
　　 (1)小麥籽粒木聚糖酶抑制蛋白熱穩(wěn)定性的研究：本試驗對國

2、產(chǎn)小麥鄭麥9023、豫麥979，冀麥22三個品種的小麥籽粒中木聚糖酶抑制蛋白的熱穩(wěn)定性進行了研究，結(jié)果顯示：保溫30min后，冀麥22的抑制活性從40-70℃保持穩(wěn)定，而豫麥979和鄭麥9023的抑制活性在50℃時殘余活力都達到最大值。在100℃保溫后，鄭麥9023中抑制活性最高，而在冀麥22中幾乎檢測不到抑制活性，即鄭麥9023籽粒中的木聚糖酶抑制蛋白熱穩(wěn)定性最好。
　　 (2)木聚糖酶固定化及小麥木聚糖酶抑制蛋白的親和吸附條

3、件的優(yōu)化：通過對固定木聚糖酶條件的優(yōu)化，結(jié)果可知戊二醛添加量、殼聚糖與戊二醛交聯(lián)時間、酶固定化pH和時間分別是50ml/L、16h、pH5.5和24h時，殼聚糖交聯(lián)戊二醛載體對木聚糖酶固定化效果最好。并且在pH6.5、溫度30℃，小麥籽粒粗蛋白提取液與固定化木聚糖酶作用50mm時，抑制劑的吸附率可達到最大值。同時在pH8.5時酶與抑制劑的結(jié)合物可達到最大程度的分離。
　　 (3)小麥木聚糖酶抑制蛋白腑基因的克?。禾崛∴嶜?023

4、籽粒灌漿期胚中的總RNA，利用RT-PCR得到cDNA，將其作為模板，根據(jù)GeneBank中已知的成熟小麥木聚糖酶抑制蛋白的基因序列設(shè)計引物克隆得到tlxi基因，將測序結(jié)果與已知序列比對后有一個核苷酸不同，將所得序列遞交到GenBank獲取序列號JQ707892。
　　 (4)木聚糖酶抑制蛋白基因tlxi在畢赤酵母中的表達：將tlxi基因構(gòu)建到載體pPIC9K上，利用釀酒酵母α因子信號肽使其在巴斯德畢赤酵母GS115中表達。