U0126對大鼠油酸性急性肺損傷早期水通道白4在肺水代謝的表達(dá)差異.pdf

1、研究目的: 急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征（Acute Lung Injury/Acute Respiratory Distress Syndrome，ALI/ARDS），是臨床常見急性呼吸衰竭的兩個階段，由心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素所導(dǎo)致的急性、進行性缺氧性呼吸衰竭，以肺水腫、呼吸困難、嚴(yán)重低氧血癥為特征性的臨床表現(xiàn)。病理生理上主要表現(xiàn)為肺泡毛細(xì)血管屏障破壞，以及肺泡腔內(nèi)高蛋白性水腫。臨床死亡率高達(dá)35-58%，是住院病人

2、后期死亡原因之一。臨床研究表明，急性呼吸窘迫綜合癥（ARDS）的患者肺泡內(nèi)液體的早期重吸收是治療關(guān)鍵。研究早期肺泡上皮細(xì)胞清除功能，對肺水代謝過程中ALI/ARDS的轉(zhuǎn)歸有重要意義。 肺泡Ⅱ型細(xì)胞（AT-Ⅱ）雖然只占肺泡表面積5%，但數(shù)量占到了60%，其功能包括液體轉(zhuǎn)運；分泌表面活性物質(zhì)；肺損傷時增生轉(zhuǎn)化為Ⅰ型細(xì)胞等。本實驗著重研究肺泡Ⅱ型細(xì)胞的液體轉(zhuǎn)運功能。 Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞基底側(cè)膜的Na+-K+-ATP酶將鈉離子泵出

3、至間質(zhì)，造成細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度降低，肺泡腔內(nèi)的鈉離子順電勢差經(jīng)上皮鈉通道進入細(xì)胞；水分子在滲透壓差的作用下經(jīng)水通道進入細(xì)胞或細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)運。疾病早期肺水腫的肺泡Ⅱ型細(xì)胞肺泡水重吸收是修復(fù)肺損傷的修復(fù)關(guān)鍵一步。 水通道在滲透性水通透中起易化作用，使水通過生物膜的速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過彌散速度。但在病理損傷的情況下，尤其是早期水通道蛋白的調(diào)節(jié)機制尚不十分明確，基于已認(rèn)識到水通道蛋白具有主動吸收水的作用，也已證實肺組織中存在1、3、4、5、8、9水

4、通道蛋白等6種水通道。但在肺損傷后，水通道蛋白在肺水腫時如何變化尚未研究。 因此，本研究選擇了在肺泡細(xì)胞中具有“干細(xì)胞”作用、又廣泛覆蓋于肺泡表面直接面對肺泡液體的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞作為靶目標(biāo)。前期工作已證明肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞也存在AQP1及AQP4；目前以AQP4為主要研究對象，在液體清除中各發(fā)揮何種作用，在正常、肺損傷早期及使用U0126抑制其MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，研究MAPKs通路阻斷前后，肺泡Ⅱ型細(xì)胞上AQP-4及其m

5、RNA量的表達(dá)變化，探討MAPKs信號通路與肺泡Ⅱ型細(xì)胞上AQP-4的聯(lián)系及其可能的分子機制，以期進一步了解MAPKs在ARDS狀態(tài)下水通道蛋白的作用，從而為治療ARDS找到新的藥物靶點。 研究方法： 健康Sprague-Dawley大鼠（南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供），體重180～220克。按隨機數(shù)字表法將動物分為3組：對照組、油酸復(fù)制ALI/ARDS肺損傷模型組、油酸+U0126氣道給藥組，對照組和油酸組各28只大鼠

6、，加藥組25只，共81只。實驗步驟大致如下： 復(fù)制油酸ARDS大鼠模型：油酸是一種具有較強毒性的飽和脂肪酸，進入機體后會造成肺組織損傷誘發(fā)并擴大氧化性肺損傷。是目前公認(rèn)較好的ARDS模型，尾靜脈注射油酸0.1ml/kg，30分鐘后放血活殺。通過動脈血氣分析、EVLW檢測、HE病理染色等指標(biāo)來判斷模型是否成功建立及大鼠肺損傷的程度。 ATⅡ細(xì)胞的分離、純化和鑒定：采用改良的胰酶消化法分離肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，用大鼠IgG免疫粘

7、附法純化細(xì)胞，臺盼蘭測細(xì)胞活力，改良的鞣酸染色法、AKP染色法及透射電鏡鑒定細(xì)胞純度。 EVLW的測定：重力法測定EVLW。在靜水壓和膠體滲透壓綜合作用下，滲出的液體減去淋巴管轉(zhuǎn)移入血管的部分為血管外肺水。根據(jù)公式計算EVLW含量。 大鼠肺泡Ⅱ型上皮AQP-4 mRNA的表達(dá)。AQP-4在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞mRNA表達(dá)的測定：Trizol提取總RNA，紫外線分光光度儀檢測其濃度。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測AQ

8、P-4 mRNA的表達(dá)。采用GELPRO32圖像分析系統(tǒng)行密度掃描，計算AQP-4 mRNA產(chǎn)物與β-actin產(chǎn)物吸光度積分的比例，作為AQP-4 mRNA表達(dá)水平，從而比較正常組、油酸組、油酸+U0126組之間AQP-4 mRNA表達(dá)量的變化。 研究結(jié)果： 1.動物ALI/ARDS模型的成功建立經(jīng)尾靜脈注入油酸0.1 ml/kg后，所有大鼠均在30s-3 min內(nèi)出現(xiàn)明顯呼吸加快，淺促，口唇皮膚以及四肢發(fā)紺，氣管插管

9、內(nèi)分泌物明顯增多等臨床表現(xiàn)。氣管插管直接呼吸空氣情況下，PH（7.16±0.132）、P02（57.51±4.644）mmHg，顯著低于正常組（P=0.000），PaO2/FiO2≤300符歐美關(guān)于ALI的診斷標(biāo)準(zhǔn)。對照組肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)無水腫、炎癥，肺泡相對干燥。油酸組可見肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)有小量出血，可見炎性細(xì)胞增多；肺泡隔增寬，肺間質(zhì)滲液明顯，油酸+U0126組肺組織病理表現(xiàn)同油酸肺損傷組。 2.大鼠ATⅡ細(xì)胞的分離純化方法是可

10、行的，經(jīng)臺盼蘭染色對照組細(xì)胞活力88.6±2.67%，ARDS組85.8±3.36%，改良的鞣酸染色法可見不均勻分布在核周的大小不一的褐色的嗜鋨小體（板層小體），細(xì)胞聚集成島狀。AKP染色法可見胞漿中有較多分不不均，大小不一的藍(lán)色顆粒。電鏡下見正常組細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則，呈圓形或立方形，表面有很多長短不一的微絨毛，核圓形，胞質(zhì)著色淺，呈泡沫狀。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含許多線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體和溶酶體；并可見特征性的嗜鋨性板層小體。電鏡下見油酸組

11、細(xì)胞變性、凋亡甚至崩解，細(xì)胞形態(tài)相對不規(guī)則，表面的微絨毛明顯減少，胞核變形，染色質(zhì)邊集，線粒體腫脹，胞漿內(nèi)各種細(xì)胞器明顯減少， 板層小體排空顯著增多而致空泡化并可見到脫落的板層小體。 3.EVLW的含量損傷模型組0.8175±0.111明顯高于對照組0.515±0.962，加藥組0.820±0.590與模型組無明顯差別，說明在肺損傷早期，就已經(jīng)存在明顯肺泡毛細(xì)血管大量滲出，滲出大于重吸收和間質(zhì)回流，給藥組并不能明顯增強肺泡上皮液

12、體清除能力。 4.經(jīng)過RT-PCR擴增后，AQP-4產(chǎn)物與β-actin產(chǎn)物吸光度積分的比例，作為AQP-4的m-RNA表達(dá)水平，對照組0.280±0.096，模型組為0.810±0.129，加藥組0.502±0.123 （F=46.815，P=0.000），油酸組合成表達(dá)明顯增加，加藥組合成表達(dá)量介于模型組和正常組之間，三者之間比較差異都有統(tǒng)計學(xué)意義。說明AT Ⅱ細(xì)胞核內(nèi)合成AQP4的mRNA合成表達(dá)量在肺水腫各種因素的作用下

13、表量是增加的；其次，給藥組表達(dá)量較油酸組減少，說明藥物影響AQP4的mRNA。 結(jié)論： 1.采用改良的胰酶消化法可以成功分離正常和油酸ARDS大鼠的AT Ⅱ細(xì)胞，用大鼠IgG包被培養(yǎng)皿純化細(xì)胞、改良的鞣酸染色法鑒定細(xì)胞純度簡單可行，透射電鏡是鑒定細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)，而APK染色鑒定ATⅡ可以與透射電鏡相媲美。 2.經(jīng)尾靜脈注射油酸復(fù)制大鼠ARDS急性模型是一個相對簡單而成功率高的方法，大鼠血液PaO2顯著下降，PaCO

14、2顯著上升，肺部出現(xiàn)明顯病理改變，上皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯早期壞死的表現(xiàn)，血氣分析、光鏡下肺損傷評分及EVLW油酸組嚴(yán)重程度顯著高于對照組，顯微鏡下肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的數(shù)量較對照組無明顯減少，但電鏡下細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)如板層小體排空，線粒體損傷，符合肺損傷及急性呼吸窘迫綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)。 3.通過氣管插管給予U0126直接抑制MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中MEK活性后，復(fù)制的大鼠ARDS，從肺組織大體形態(tài)、血氣分析、病理、肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞

15、電鏡下形態(tài)等來看，與油酸組無明顯差別，肺毛細(xì)血管滲透性下降，間質(zhì)水腫明顯，肺泡上皮細(xì)胞主動重吸收較油酸組無明顯加強，體現(xiàn)在血管外肺水并未明顯下降，說明給予U0126直接抑制MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中MEK活性后，早期并未明顯改善油酸所致大鼠肺水腫液體重吸收。但肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中AQP4的mRNA表達(dá)量在U0126組較油酸組表達(dá)量明顯減少，因而可以知道在ARDS形成中，MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可以調(diào)節(jié)早期ARDS大鼠的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中AQP4的