HO-1在富氫水保護(hù)大鼠急性肺損傷中的作用.pdf

1、目的：
　　急性肺損傷（acute lung injury, ALI）是各種肺內(nèi)外因素引起的急性彌漫性肺組織損傷，其主要特點是肺部過度炎癥反應(yīng)和肺血管通透性增加。革蘭氏陰性細(xì)菌感染是ALI的常見病因之一。細(xì)菌內(nèi)毒素的主要活性成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可由其受體介導(dǎo)直接激活肺內(nèi)炎癥細(xì)胞，釋放大量炎癥介質(zhì)，并由此引發(fā)瀑布式炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致彌漫性肺組織損傷。ALI持續(xù)發(fā)展可導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征甚至多系統(tǒng)器

2、官功能衰竭。盡管近年來各種支持療法有了很大進(jìn)展，但ALI的具體發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，病死率仍高達(dá)40％以上。目前大部分觀點認(rèn)為中性粒細(xì)胞的活化，炎癥因子和炎癥介質(zhì)的大量釋放，氧化應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞凋亡等在內(nèi)毒素性肺損傷的發(fā)病機(jī)制中起了重要的作用，而肺內(nèi)過度的失控的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致ALI的根本原因。
　　在缺血或炎癥等病理情況下，體內(nèi)會大量產(chǎn)生自由基并導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷，過量產(chǎn)生的氧自由基會導(dǎo)致DNA、脂質(zhì)和蛋白的氧化損傷，其中羥自由基

3、(·OH)的毒性最強，并且到目前為止還沒有發(fā)現(xiàn)哺乳動物體內(nèi)內(nèi)源性針對·OH的清除途徑。近來，Ohsawa等發(fā)現(xiàn)了氫氣分子可選擇性清除細(xì)胞體系中的·OH，動物呼吸氣體中一定濃度的氫氣可以有效緩解腦缺血再灌注損傷[1]。在生物體內(nèi)，氫氣可以發(fā)揮抗氧化作用，保護(hù)多種細(xì)胞和組織器官免受過氧化損傷。另外，氫氣分子在肝臟、腎臟及內(nèi)分泌系統(tǒng)等方面均有保護(hù)作用。有研究認(rèn)為氫預(yù)處理對缺血/再灌注所致ALI具有保護(hù)作用，能抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高肺組織SOD

4、活性，降低MDA、MPO及細(xì)胞因子的表達(dá)，降低肺組織病理損害，這一啟動機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)的作用已初見端倪，但其詳細(xì)作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。并且氫后處理對ALI是否起到相同的作用也值得近一步研究。
　　內(nèi)源性氣體信號分子之間存在著相互調(diào)節(jié)的關(guān)系。已有研究證實CO、NO與H2S之間可對彼此產(chǎn)生的限速酶進(jìn)行調(diào)節(jié)，而關(guān)于H2與他們之間相互關(guān)系的報道尚不多見。CO已被證實可減輕LPS所致的肺損傷，尤其對PMN的浸潤有明顯的抑制作用[12]。機(jī)

5、體內(nèi)源性CO主要由HO催化血紅素降解產(chǎn)生。誘導(dǎo)型HO，即HO-1，又稱為熱休克蛋白32，可作為保護(hù)性蛋白被細(xì)菌內(nèi)毒素、炎性細(xì)胞因子、血紅素及其降解產(chǎn)物、NO、低氧、高氧等多種因素誘導(dǎo)表達(dá)，保護(hù)組織免受氧化應(yīng)激損傷。而關(guān)于ALI時CO與氫之間相互關(guān)系如何，尚未見相關(guān)報道。另外，研究表明，HO-1是一種內(nèi)源性的細(xì)胞保護(hù)蛋白，具有抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗細(xì)胞凋亡的作用。那么，在H2對ALI的作用中，HO-1/CO發(fā)揮了何種作用？這也是我們感興趣的

6、問題之一。有研究表明HO-1的誘導(dǎo)表達(dá)可降低實驗動物對致死劑量LPS的敏感性，提高生存率。可見HO-1/CO通路在對抗內(nèi)毒素導(dǎo)致的組織損傷中具有重要作用。H2對HO-1/CO通路是否有調(diào)節(jié)作用，作用機(jī)制尚不清楚。
　　P38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPKs)家族中的一員。p38MAPK在凋亡、細(xì)胞因子產(chǎn)生、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及缺血再灌注損傷中起重要作用，與炎癥也有密

7、切關(guān)系。有文獻(xiàn)報道，P38MAPK介導(dǎo)了某些因素對HO-1的誘導(dǎo)，而H2可激活主動脈平滑肌細(xì)胞通路，由此我們推測，P38MAPK可能是CO和H2之間相互調(diào)節(jié)的連接紐帶。這是本研究所要解決的另一個問題。
　　為此，本實驗以內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠為模型，探討HO-1在ALI的肺組織中的表達(dá)的作用，以及其與炎癥因子和促凋亡因子之間的關(guān)系，探討HO-1在富氫水對ALI保護(hù)的作用。同時，通過本實驗研究，試圖探討P38MAPK在富氫水對HO

8、-1調(diào)節(jié)中的作用，從而為尋求ALI新的防治思路和方法提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　方法：
　　1、實驗動物及其模型構(gòu)建
　　健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體重220-250g，腹腔麻醉后，靜脈注射LPS(E.Coli，O55∶B5)10mg/kg,構(gòu)建ALI大鼠模型。
　　2、肺臟組織光鏡標(biāo)本的制備與觀察
　　采用4％多聚甲醛溶液固定腫組織，常規(guī)石蠟包埋、切片，切片厚5μm，行HE染色，AX70

9、 OLYMPUS光學(xué)顯微鏡觀察、攝片。
　　3、肺臟組織電鏡標(biāo)本的制備與觀察
　　大鼠放血處死，迅速取出肺臟組織，減壓后固定于4℃、2.5％戊二醛固定液中4h，JEM-1200EX型透射電子顯微鏡下觀察、攝片。
　　4、TNF-α和IL-1定量檢測
　　采用ELISA方法，分別檢測肺組織TNF-α和IL-1分泌水平。酶標(biāo)儀測定450nm處OD值。結(jié)果以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)用SoftMax Pro4.

10、3.1LS軟件分析，計算細(xì)胞因子含量（pg/ml）。
　　5、肺組織中丙二醛(MDA)含量、髓過氧化物酶(MPO)活性測定
　　MDA檢測:取肺組織勻漿0.1ml，加入反應(yīng)液后測定其在532nm處的吸光度值，考馬斯亮藍(lán)蛋白測定法檢測肺組織勻漿液中蛋白濃度。
　　MPO檢測:將肺組織剪碎勻漿，加入反應(yīng)液0.5％十六烷基三甲基溴化胺溶液，測定其在460nm處30秒到90秒內(nèi)的光密度值（OD值）變化。
　　6、HO-1

11、、總p38MAPK、磷酸化p38MAPK激酶蛋白表達(dá)
　　Westemblot方法檢測肺組織HO-1、總p38MAPK、磷酸化p38MAPK激酶蛋白表達(dá)。
　　7、統(tǒng)計學(xué)分析
　　實驗數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析。兩組間比較用t檢驗，各組件比較采用方差分析，所有數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，以P＜0.05為統(tǒng)計學(xué)上差異有顯著性。
　　結(jié)果：
　　1、大鼠生理指標(biāo)的變化
　　大鼠在給LP

12、S后，MAP均有不同程度的降低，在給藥組大鼠血壓1h后開始明顯下降，內(nèi)毒素處理組間未達(dá)到顯著性水平。對照組的PaO2明顯高于其他各組，PaCO2明顯低于其他各組，其他各組間比較無顯著性差異。對照組的濕-干重比率(W/D)明顯低于其他各組，差別有顯著性意義(P＜0.05)。
　　2、肺臟組織光鏡標(biāo)本的制備與觀察
　　對照組肺組織內(nèi)細(xì)支氣管及各級分支的形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。肺泡壁由肺泡上皮細(xì)胞和肺泡隔構(gòu)成，肺泡隔較窄，其上可見毛細(xì)血管;

13、肺泡孔明顯;肺泡腔大小正常，其內(nèi)未見有炎性細(xì)胞和滲出物。LPS處理組可見肺泡腔及肺間質(zhì)彌漫性炎細(xì)胞浸潤，肺泡間隔增寬，部分區(qū)域肺泡隔斷裂，肺泡萎陷、甚至結(jié)構(gòu)消失，部分肺泡內(nèi)見出血。富氫水處理組上述病變明顯減輕，局部肺組織僅有少量炎細(xì)胞浸潤，肺泡隔略有增寬。
　　3、肺臟組織電鏡標(biāo)本的制備與觀察
　　對照組Ⅱ型肺泡細(xì)胞體積較大，呈立方形，細(xì)胞表面微絨毛較多。核較大，呈圓形，核內(nèi)異染色質(zhì)少。胞質(zhì)內(nèi)可見少量嗜鋨性板層小體，其板層清

14、晰，可見線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。內(nèi)毒素組肺泡Ⅱ型肺泡核膜模糊、水腫，核內(nèi)染色質(zhì)邊集、凝聚，線粒體嵴減少，外膜破壞，板層小體大部分排空，部分有存留。富氫水治療組Ⅱ型肺泡核膜較模糊，略有水腫，核內(nèi)染色質(zhì)部分邊集、凝聚，線粒體嵴略減少，外膜較完整，板層小體大部分有存留。
　　4、TNF-α和IL-1定量檢測
　　L組、ZnPP、H-ZnPP組明顯高于C組(P＜0.01)，說明LPS造成急性肺損傷模型成立。HL、Hm、和H-Hm治療能明

15、顯降低TNF-α和IL-6的水平。
　　5、肺組織中丙二醛(MDA)含量、髓過氧化物酶(MPO)活性測定
　　與對照組比較，內(nèi)毒素處理組的MDA和MPO均有所增高，其中以ZnPP組最高。HL、Hm、、H-Hm和HSL組較L組的MDA和MPO明顯降低。
　　6、HO-1、總p38MAPK、磷酸化p38MAPK激酶蛋白表達(dá)
　　內(nèi)毒素處理組HO-1表達(dá)均高于C、H組(P＜0.05)，富氫水組HO-1水平要高于內(nèi)毒素組

16、，說明富氫水能夠進(jìn)一步上調(diào)HO-1的表達(dá)。HSL組HO-1表達(dá)要高于HL組。與對照組比較，L、HL、HSL組的p-p38均增高;與L組比較，HL、HSL組p-p38降低。
　　結(jié)論：
　　1、氧化和抗氧化反映的失衡參與了ALI的發(fā)生機(jī)制。
　　2、富氫水和HO-1對ALI大鼠有保護(hù)作用。
　　3、富氫水可能通過上調(diào)HO-1的表達(dá)對大鼠急性肺損傷起到保護(hù)作用。
　　4、富氫水能夠抑制p38MAPK信號通路的激