雷洛昔芬對(duì)鎘染毒大鼠成骨細(xì)胞維生素D受體的影響.pdf

1、目的：通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞及建立鎘染毒細(xì)胞模型，觀察染鎘及雷洛昔芬干預(yù)后成骨細(xì)胞的存活率以及雌激素受體α(Estrogen receptorα，ERα)和維生素D受體(vitamin Dreceptor，VDR)在細(xì)胞中的表達(dá)，探討雷洛昔芬(raloxifene，RAL)對(duì)鎘染毒成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)的作用及機(jī)制，為臨床治療慢性鎘中毒所致骨損害提供新的方法。
　　方法：選取出生不足24h的新生大鼠5只，通過(guò)胰酶

2、和Ⅰ型膠原酶消化，從顱項(xiàng)骨中分離提取出成骨細(xì)胞，對(duì)所提取的成骨細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定。進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)檢測(cè)均選用第4代細(xì)胞。用CCK-8法檢測(cè)不同濃度鎘染毒和雷洛昔芬干預(yù)后各組成骨細(xì)胞的存活率，選取適宜的鎘和雷洛昔芬濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將成骨細(xì)胞分為對(duì)照組，氯化鎘組及雷洛昔芬組。用Trizol法提取各組成骨細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出目的片段，測(cè)定各組成骨細(xì)胞中ERα和VDR基因表達(dá)情況;提取

3、細(xì)胞總蛋白，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)鎘染毒后以及雷洛昔芬干預(yù)后成骨細(xì)胞中VDR蛋白的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：原代成骨細(xì)胞貼壁前呈均勻球形，約24h開始貼壁，48～96h完全貼壁，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或多角形，與其他文獻(xiàn)報(bào)道一致;對(duì)照組成骨細(xì)胞形態(tài)正常，與培養(yǎng)皿底貼合緊密;氯化鎘組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，與培養(yǎng)皿底貼合不緊密，約50％細(xì)胞死亡;與氯化鎘組相比，雷洛昔芬

4、組少數(shù)細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變，與培養(yǎng)皿底貼合較為緊密，約20％細(xì)胞死亡。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示:與對(duì)照組相比，氯化鎘組細(xì)胞活力明顯下降(P＜0.01)，細(xì)胞存活率與鎘濃度呈反比(24h:r=-0.956, P＜0.01;48h: r=-0.992, P＜0.01),1μmol/LCdCl2作用24h即可使成骨細(xì)胞存活率由100.00％下降至85.49％，8μmol/L CdCl2作用24h后，成骨細(xì)胞存活率下降至50.22％;與氯化鎘組相比，雷洛

5、昔芬組成骨細(xì)胞活力顯著增加(P＜0.01)，細(xì)胞存活率與雷洛昔芬濃度呈正比(24h: r=0.877，P＜0.01;48h:r=0.965，P＜0.01)，1mg/L RAL干預(yù)24h細(xì)胞存活率無(wú)明顯改變，而8mg/L RAL干預(yù)24h后細(xì)胞存活率可高達(dá)152.67％。RT-PCR顯示:與對(duì)照組相比，氯化鎘組成骨細(xì)胞內(nèi)ERα表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，VDR基因表達(dá)明顯下降(P＜0.05);而與氯化鎘組相比，雷洛昔芬組成骨細(xì)胞內(nèi)ERα表達(dá)

6、下降(P＜0.05)，VDR基因表達(dá)顯著增高(P＜0.05)。蛋白印跡結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，氯化鎘組成骨細(xì)胞內(nèi)VDR蛋白表達(dá)明顯下降(P＜0.05);與氯化鎘組相比，雷洛昔芬組成骨細(xì)胞內(nèi)VDR蛋白表達(dá)顯著增高(P＜0.05)，結(jié)果與RT-PCR一致。
　　結(jié)論：鎘可以通過(guò)其類雌激素作用對(duì)成骨細(xì)胞產(chǎn)生直接毒性，其機(jī)制可能是通過(guò)與ERα結(jié)合下調(diào)成骨細(xì)胞內(nèi)VDR的表達(dá);而雷洛昔芬可以干預(yù)鎘的類雌激素作用，通過(guò)拮抗鎘下調(diào)成骨細(xì)胞內(nèi)VDR