5-FU免疫納米微粒制備及抗胃癌作用的研究.pdf

1、胃癌是惡性腫瘤的主要致死原因，在全世界占惡性腫瘤死亡的第二位。手術(shù)是唯一有可能治愈胃癌的治療手段，但仍有部分病例將死于疾病的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，主要是局部或區(qū)域性的復(fù)發(fā)。因此局部或全身化療是治療胃癌的重要手段之一，然而由于抗胃癌藥物的普通制劑給藥后在全身分布，殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)也損傷正常細(xì)胞，產(chǎn)生較大的不良反應(yīng)。近些年來由于納米技術(shù)的飛速發(fā)展，在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用也日益得到了人們的重視，特別是在腫瘤的診斷和治療方面，使腫瘤化療更具靶向性，副作用減少。

2、 納米是一個(gè)長度單位，1nm=10-9m(即十億分之一米)，納米微粒是粒徑10nm～500nm固狀膠態(tài)粒子。納米技術(shù)是指在納米尺度空間內(nèi)操縱原子和分子，對材料進(jìn)行加工，制造具有特定功能的產(chǎn)品或?qū)ξ镔|(zhì)及其結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，是現(xiàn)代物理學(xué)、化學(xué)和先進(jìn)工程技術(shù)相結(jié)合的高技術(shù)學(xué)科。 用于惡性腫瘤診斷和治療的藥物納米載體主要由金屬納米顆粒、無機(jī)非金屬納米顆粒、生物降解性高分子納米顆粒和生物性顆粒構(gòu)成。生物降解性是藥物納米載體的重要特征之一

3、，納米載體與藥物定向進(jìn)入靶細(xì)胞之后，通過降解，藥物釋放出來發(fā)揮療效。迄今研究最多、應(yīng)用最廣的就是聚乳酸等，聚乳酸具有優(yōu)良的生物相容性，在人體內(nèi)代謝的最終產(chǎn)物是水和二氧化碳。 制備載藥聚乳酸納米微粒的主要方法有溶劑蒸發(fā)法、自乳化溶劑擴(kuò)散法、鹽析法/乳化-擴(kuò)散技術(shù)，同時(shí)為延長聚乳酸納米微粒在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，聯(lián)接特異抗體，進(jìn)行聚乳酸納米微粒的表面修飾如利用白蛋白附于聚乳酸納米微粒的表面，白蛋白的氨基通過偶聯(lián)化合物與抗體分子氨基結(jié)合載藥

4、納米微粒形成具有免疫活性的載藥納米復(fù)合物。 納米控釋系統(tǒng)包括納米粒子和納米膠囊，其釋放機(jī)理可以是藥物通過囊壁瀝濾、滲透和擴(kuò)散出來，也可以是基質(zhì)本身的溶蝕而使其中的藥物釋放出來，能保持血液中藥物的有效濃度在一個(gè)比較穩(wěn)定的水平，有利于藥物達(dá)到最佳治療效果，同時(shí)減小系統(tǒng)毒性。靶向定位給藥就是根據(jù)臨床需要，通過選用對機(jī)體各種組織或病變部位親和力不同的載體制作載藥微粒，或?qū)慰寺】贵w與載體結(jié)合，使藥物能夠輸送到治療期望到達(dá)的特定部位。選擇

5、導(dǎo)引抗體為載藥納米微粒的生物主動(dòng)靶向治療的關(guān)鍵。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在生理及病理?xiàng)l件下，具有很強(qiáng)的促血管形成作用，能調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的多種生物學(xué)功能。多個(gè)研究表明，胃癌VEGF蛋白過度表達(dá)與胃癌血管形成和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，而且是胃癌病人預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立預(yù)測因素。VEGF及其受體在消化系惡性腫瘤中的高表達(dá)啟發(fā)我們：以VEGF及其受體為靶點(diǎn)的抗腫瘤血管形成是一新的治療腫瘤手段。 本研究以PLA納米微粒為藥物載體，采用超聲乳化法制備

6、納米微粒，將抗癌藥物5-FU包埋制備載藥納米微粒，用牛血清白蛋白(BSA)作為納米微粒的表面修飾材料，與人源化抗VEGF抗體以化學(xué)反應(yīng)鍵相連，制備出抗體導(dǎo)向的具有免疫活性的5-FU-Ab-NPs。二者結(jié)合作用于腫瘤局部，通過提高局部藥物濃度，并抑制血管生成來抑制胃癌的生長。 根據(jù)以上內(nèi)容，本文擬從以下幾個(gè)方面進(jìn)行研究： 1、以5-FU為模型藥物，PLA為載體材料，制備5-FU-NPs。對5-FU-NPs的形貌、粒徑分布、

7、結(jié)構(gòu)、表面元素、體外釋放等性能進(jìn)行考察。 2、采用MTT比色法評價(jià)5-FU-NPs對胃癌細(xì)胞增殖的影響，考察5-FU-NPs對胃癌細(xì)胞株增長的抑制效果。 3、用人源化抗VEGF單克隆抗體與5-FU-NPs連接，制備具有靶向功能的5-FU-Ab-NPs，考察其形貌、粒徑分布、體外釋放和免疫活性等性能。 4、建立SCID鼠人胃癌腫瘤移植模型，使用同位素99m锝(99mTc)標(biāo)記5-FU-Ab-NPs，檢測其在SCID

8、裸鼠人胃癌腫瘤移植模型體內(nèi)分布和5-FU在腫瘤內(nèi)的濃度。 5、觀察5-FU-Ab-NPs對SCID裸鼠人胃癌腫瘤移植模型的治療效應(yīng)。 希望通過這幾種實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)和研究，為今后靶向藥物控釋系統(tǒng)的研究和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。 第一部分研究內(nèi)容和方法醫(yī)用納米控釋系統(tǒng)作為藥物傳遞和控釋的載體，是一種新型的控釋體系。它具有超微小體積，能穿過組織間隙并被細(xì)胞攝取，可通過人體的毛細(xì)血管間隙和血腦屏障，因而作為一種新的控釋體系而被

9、廣泛研究，具有廣闊的發(fā)展前景。本研究是對5-FU-NPs的表面形貌、粒徑分布、微粒結(jié)構(gòu)、表面元素、體外釋放等微粒性能進(jìn)行考察與評價(jià)。以可溶性聚乳酸為載體，5-FU為模型藥物，采用超聲乳化法制備5-FU-NPs，電子顯微鏡觀測5-FU-NPs外形結(jié)構(gòu)，用紫外分光光度計(jì)測得5-FU-NPs載藥量、包封率，并測定體外釋放量，光電能譜儀測定5-FU-NPs表面元素。 小結(jié)以5-FU-NPs作為5-FU載體，可改變5-FU在體內(nèi)

10、的藥代動(dòng)力學(xué)行為，具有緩釋作用，可制備為靜脈用藥，延長藥物在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，發(fā)揮更好的抗腫瘤效應(yīng)。 第二部分5-FU-NPs對胃癌細(xì)胞株體外殺傷效應(yīng)作用的研究研究內(nèi)容和方法 用四唑鹽顯色法(MTT法)檢測用不同劑量的5-FU-PLA-NPs和5-FU在1～10d內(nèi)10個(gè)時(shí)間點(diǎn)對胃癌細(xì)胞株的生長抑制作用，計(jì)算出2種藥物在10個(gè)時(shí)間點(diǎn)對癌細(xì)胞抑制率和藥物半數(shù)抑制率的濃度。 小結(jié)經(jīng)改型后的5-FU-NPs沒有

11、降低5-FU成份的抗癌作用。 第三部分抗VEGF單克隆抗體偶聯(lián)5-FU-NPs的研究研究內(nèi)容和方法 采用超聲乳化法制備5-FU-NPs，以抗VEGF單克隆抗體與5-FU-NPs以化學(xué)鍵偶聯(lián)連接的方法制備具有靶向功能的5-FU-Ab-NPs，考察其形貌、粒徑分布、體外釋放和免疫活性等性能。 小結(jié)5-FU-Ab-NPs保持原5-FU-NPs緩釋藥物的特點(diǎn)，具有雙重活性功能，即免疫導(dǎo)向和緩釋藥物，有利于提高腫

12、瘤局部藥物濃度。 第四部分99mTc標(biāo)記5-FU-Ab-NPs在荷人胃癌SCID鼠體內(nèi)分布的研究研究內(nèi)容和方法 探索99mTc標(biāo)記5-FU-Ab-NPs方法，觀察99mTc-5-FU-Ab-NPs在胃癌移植瘤模型體內(nèi)的分布情況。用γ計(jì)數(shù)儀測定放射強(qiáng)度，計(jì)算腫瘤和非腫瘤組織的單位質(zhì)量攝取放射性活度的百分比(ID％/g)和腫瘤與非腫瘤組織的放射性比值(T/NT)。用高效液相測譜議檢測實(shí)驗(yàn)組及對照組血液、腫瘤和非腫瘤組織5-F

13、U的濃度。 結(jié)果所制備的99mTc-5-FU-Ab-NPs無毒、無菌、無熱原，性質(zhì)穩(wěn)定，標(biāo)記率在90％～95％，抗體的活性在標(biāo)記前后無明顯改變。注射99mTc-5-FU-Ab-NPs后，各時(shí)相腫瘤組織ID％/g均顯著高于注射99mTc-5-FU-鼠IgG-NPs的對照組(P＜0.05)，注射99mTc-5-FU-Ab-NP后2h和6h，腫瘤組織ID％/g和腫瘤與血液的放射性比值(T/B)分別從4.11±1.47和1.36±0.8

14、3，增加到7.31±0.62和2.87±0.56，差異有顯著性(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織5-FU濃度高于對照組。 小結(jié)所制備的99mTc-5-FU-Ab-NPs，能較好地滿足放射免疫顯像的要求，抗VEGF單克隆抗體的免疫導(dǎo)向作用可靠，注射后6h，99mTc-5-FU-Ab-NPs在腫瘤組織中有相對較高的特異性濃聚。 第五部分5-FU-Ab-NPs對荷人胃癌SCID鼠抗腫瘤效果的研究內(nèi)容和方法 觀察5-FU-

15、Ab-NPs對SCID鼠人胃癌移植模型的治療效應(yīng)，建立SCID鼠人胃癌移植腫瘤模型，觀察藥物對高表達(dá)VEGF胃癌移植腫瘤模型治療效應(yīng)和肝腎損害等不良反應(yīng)。 小結(jié)5-FU-Ab-NPs可提高5-FU的抑瘤率，并通過抑制腫瘤的血管生成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，增加療效，有效降低5-FU的骨髓抑制和肝腎功能損害作用，是一種安全的新型藥物靶向制劑。 結(jié)論1、本研究制備5-FU-NPs呈規(guī)則圓形，表面光滑，粒徑范圍在100～2

16、00nm，載藥率為15.2％，包封率為45.6％。具有緩釋藥物行為。其與5-FU原藥一樣具有相同的抗胃癌活性。 2、5-FU-NPs與抗VEGF單克隆抗體經(jīng)偶聯(lián)后所得的5-FU-Ab-NPs，保持原有5-FU-NPs緩釋藥物的特點(diǎn)，并具備其原免疫活性，抑制胃癌的血管生成。3、99mTc標(biāo)記5-FU-Ab-NPs，顯示其能濃聚在荷瘤SCID鼠胃癌組織中，實(shí)現(xiàn)針對腫瘤組織的靶向緩釋給藥。 4、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明5-FU-Ab-NP