攜帶凋亡素VP3基因重組腺病毒的制備及其在人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、目的：利用細(xì)菌內(nèi)同源重組法構(gòu)建攜帶凋亡素VP3基因的重組腺病毒,為凋亡素VP3基因在治療結(jié)腸癌方面的研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：設(shè)計(jì)VP3 cDNA擴(kuò)增引物,從PET15b-VP3質(zhì)粒中擴(kuò)增VP3的DNA序列,與pShuttle-IRES-hrGFP-2進(jìn)行連接構(gòu)建pShuttle-VP3-hrGFP穿梭質(zhì)粒,PCR和EcoRⅤ酶切電泳鑒定;穿梭質(zhì)粒pShuttle-VP3-hrGFP經(jīng)Pmel酶切線性化后,轉(zhuǎn)化含pAdeasy-1

2、的超感受態(tài)BJ5183大腸桿菌,細(xì)菌內(nèi)同源重組法構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAd-VP3-hrGFP,質(zhì)粒經(jīng)PCR、PacI酶切電泳及測(cè)序鑒定,線性化的腺病毒質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞,進(jìn)行重組腺病毒pAd-VP3-hrGFP的包裝和擴(kuò)增,采用CsCI密度梯度離心法進(jìn)行病毒濃縮和純化并將其感染人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),觀察其感染效率及表達(dá)水平。
　　結(jié)果：pShuttle-VP3-hrGFP穿梭質(zhì)粒構(gòu)建鑒定成功。線性化的pSh

3、uttle-VP3-hrGFP轉(zhuǎn)化含pAdeasy-1的超感受態(tài)BJ5183大腸桿菌,重組質(zhì)粒經(jīng)酶切獲得一大于23kb的大片段和4.5kb的片段,PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了402bp的片段,重組質(zhì)粒測(cè)序證實(shí)VP3-hrGFP編碼區(qū)成功地克隆入了腺病毒pAd中,且其序列與GeneBank中VP3 CDNA序列完全一致。成功包裝出攜帶VP3基因的腺病毒,滴度為1.738×1012opu/ml,獲得的重組腺病毒對(duì)SW480細(xì)胞的感染效率高于98％以上