腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體與硝普鈉聯(lián)合誘導膠質(zhì)瘤細胞株U251凋亡的實驗研究.pdf

1、背景:腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand，TRAIL)是腫瘤壞死因子家族新成員，在體內(nèi)外實驗中均表現(xiàn)出選擇性誘導腫瘤細胞凋亡的作用，對正常組織無明顯毒性，系統(tǒng)用藥時肝臟副作用小，對于包括腦膠質(zhì)瘤在內(nèi)的各種惡性腫瘤治療有良好的應用價值和前景。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)不同腫瘤對于TRAIL作用的反應性不一，約半數(shù)以上的腫瘤對TRAIL存在潛在

2、的和獲得性的耐藥，限制了抗腫瘤治療的臨床應用。因此目前研究的重點在于尋找影響腫瘤細胞對TRAIL的反應因素及腫瘤細胞對TRAIL的耐藥機制，從而提高TRAIL的抗腫瘤效應。已有研究證實，TRAIL與各種抗腫瘤藥物、射線等其他因素聯(lián)合應用能有效提高其抗腫瘤作用、克服腫瘤對TRAIL耐藥性，同時發(fā)現(xiàn)許多藥物是TRAIL凋亡誘導作用的增敏劑，如細胞毒性藥物、小分子靶向藥物、干擾素等。這些藥物通過增強內(nèi)源性和外源性凋亡信號、抑制抗凋亡因子、激活

3、促凋亡因子等途徑達到增強TRAIL對腫瘤細胞凋亡誘導作用目的。目前，發(fā)現(xiàn)新的、有效的TRAIL凋亡誘導增敏劑，并探索其增敏作用的相關(guān)機制是TRAIL的抗腫瘤作用研究中的重要方向。一氧化氮(Nitric oxide，NO)是一種在生理和病理狀態(tài)下細胞凋亡的調(diào)節(jié)因子，對正常細胞和腫瘤細胞均具有雙向凋亡調(diào)節(jié)作用。生理水平或更低水平的NO可促進細胞抵抗某些凋亡誘導因素，而持續(xù)高濃度的NO可通過活化caspase蛋白酶家族，促進細胞釋放細胞色素C

4、(Cytochrome C，CytC)，上調(diào)p53基因，改變凋亡相關(guān)蛋白如Bcl-2表達，促進細胞凋亡。硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）是傳統(tǒng)的NO供體藥物，被廣泛用于NO相關(guān)的細胞生物學研究，有研究表明SNP可誘導腫瘤細胞凋亡，其作用機制主要依賴于SNP釋放的活性分子NO，NO可激活細胞內(nèi)多種促凋亡分子，誘導細胞凋亡。本實驗以人膠質(zhì)瘤細胞株U251為實驗模型，將SNP作為TRAIL誘導U251細胞凋亡的增敏劑

5、，觀察TRAIL與SNP聯(lián)合作用對U251細胞的生長抑制的影響協(xié)同作用，研究不同濃度SNP對TRAIL誘導的腫瘤細胞凋亡作用，并通過檢測與細胞凋亡相關(guān)的調(diào)控蛋白的表達初步探討其可能的協(xié)同作用機制，以期為提高TRAIL體外抗腫瘤效應，克服腫瘤細胞對TRAIL耐藥的進一步研究提供理論依據(jù)，從而為膠質(zhì)瘤的治療增添新的思路。
　　 方法:1細胞培養(yǎng):膠質(zhì)瘤細胞株U251在含10％胎牛血清(fetal bovineserum，F(xiàn)BS)的D

6、MEM/F12培養(yǎng)基中于37℃、5％C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。2 TRAIL、SNP及二者聯(lián)合作用U251細胞形態(tài)學變化:以TRAIL(800ng/ml)、SNP(0.5mM)單藥及二者聯(lián)合作用于U251細胞，于37℃、5％CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，于第12h、第24h用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。3 MTT法測定U251細胞生長抑制率。3.1 TRAIL、SNP及二者聯(lián)合作用對U251細胞的生長抑制率:取對數(shù)生長期

7、的U251細胞，將TRAIL(800ng/ml)、SNP(0.5mM)及二者聯(lián)合作用于U251細胞24h，等量DMEM/F12培養(yǎng)基作為空白對照，采用MTT比色法測定OD值并計算各組U251細胞生長抑制率％=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100％。3.2不同濃度SNP對U251細胞的生長抑制率:取對數(shù)生長期的U251細胞，將不同濃度SNP(0.2，0.5，1.0，1.5，2.0 mM)作用于U251細胞24h，等量DMEM/F12

8、培養(yǎng)基作為空白對照，行MTT比色法測定測定每孔吸光度值（OD值），并計算細胞生長抑制率％=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100％。4 Griess法測定U251細胞內(nèi)NO含量:取Griess法細胞NO檢測試劑盒中的NaNO2標準品，用DMEM/F12細胞培養(yǎng)基稀釋成不同濃度(0，1，2，5，10，20，40，60，100μM)，用Griess法檢測標準品NO含量并繪制標準曲線。以0.2，0.5，1.0，1.5，2.0 mM不同濃度

9、的SNP作用于U251細胞24h，用Griess法測定細胞內(nèi)NO含量。5 AnnexinV-FITC/PI雙染法流式細胞術(shù)檢測U251細胞凋亡率:取對數(shù)生長期的U251細胞，按分組予以不同處理因素:TRAIL組(800ng/ml)、SNP組(0.5mM)、聯(lián)合作用組（TRAIL濃度為800ng/ml+SNP濃度為0.5mM）、空白對照組（等量DMEM/F12培養(yǎng)基）作用24h，進行流式細胞檢測，用Cell Quest軟件進行數(shù)據(jù)分析。認

10、為Annexin V-FITC+PI+和Annexin V-FITC+PI-為凋亡細胞，每次計數(shù)10000個細胞，計算凋亡率。6 Western blot法測定U251細胞DR5、caspase-3、survivin、Bcl-2蛋白表達:取對數(shù)生長期細胞，以TRAIL(800ng/ml)、SNP(0.5mM)及二者聯(lián)合作用24h，以等量DMEM/F12培養(yǎng)基為空白對照，westernblot法測定各組細胞DR5、caspase-3、su

11、rvivin、Bcl-2、β-Actin表達，以β-Actin作為內(nèi)參照，用AlphaEase FC軟件分析，測定各組靶蛋白及內(nèi)參照蛋白的灰度值，以同一樣品中目的蛋白與內(nèi)參灰度值的比值作為蛋白的相對含量。7統(tǒng)計分析:實驗數(shù)據(jù)用SPSS19.0軟件分析，結(jié)果用均數(shù)±標準差((x)±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:1倒置相差顯微鏡下U251細胞形態(tài)變

12、化:對照組U251細胞呈不規(guī)則梭形，突觸較多，折光度好，胞漿豐富，邊緣清晰，與培養(yǎng)板黏合緊密。TRAIL作用12h、24h后，見部分細胞變圓、縮小，折光度降低，黏附性降低，并隨著時間延長，變化細胞數(shù)量增多。TRAIL與SNP聯(lián)合用藥作用24h后，可見大量細胞變圓、縮小、脫壁，邊緣毛糙，折光度降低，可見胞膜包裹的細胞碎片。2TRAIL、SNP與二者聯(lián)合應用對膠質(zhì)瘤細胞株U251的生長抑制作用:MTT法分別檢測TRAIL、SNP與二者聯(lián)合作

13、用對U251細胞的生長抑制作用，結(jié)果顯示TRAIL(800ng/ml)作用24h后U251細胞的生長抑制率為(59.272±3.197)％，顯示出對U251細胞的顯著生長抑制作用。SNP(0.5mM)作用24h后對U251細胞的生長抑制率為(35.467±3.091)％，對U251細胞同樣有生長抑制作用，兩者聯(lián)合應用對U251細胞的生長抑制率為(77.425±1.702)％，較TRAIL單藥作用組和SNP單藥作用組顯著提高(F=351.

14、522，P=0.000)，組間存在顯著性差異(P＜0.01)。3用Griess法測定不同濃度SNP作用后細胞內(nèi)NO含量，①不同濃度(0.2 mM，0.5 mM，1.0 mM，1.5 mM，2.0mM)的SNP作用U251細胞內(nèi)NO含量分別為(0.708±0.070)％，(2.673±0.246)％，(4.587±0.770)％，(6.965±0.141)％，(10.931±0.827)％，隨著SNP濃度的增高，細胞內(nèi)NO含量遞增。不同濃

15、度(0.2 mM，0.5 mM，1.0 mM，1.5 mM，2.0mM)的SNP對U251細胞生長抑制率分別為(12.913±3.700)％，(35.993±2.808)％，(50.117±3.131)％，(61.141±2.355)％，(74.468±2.259)％。顯示隨著SNP濃度的增高，U251細胞生長抑制率逐步遞增。②結(jié)合同濃度SNP對細胞生長的抑制作用，表明隨著NO濃度增高，細胞生長抑制率升高，存在相關(guān)性(P＜0.01)。4

16、TRAIL、SNP及二者聯(lián)合誘導U251細胞凋亡:流式細胞術(shù)檢測TRAIL、SNP及二者聯(lián)用的細胞凋亡率，統(tǒng)計早期凋亡和晚期凋亡細胞所占比率，結(jié)果提示對照組凋亡率為(8.20±0.81)％，而SNP單藥作用凋亡率為(26.88±4.19)％，TRAIL單藥作用凋亡率為(36.87±3.69)％，均與對照組存在顯著差異(P＜0.01);TRAIL與SNP聯(lián)用時凋亡率上升至（67.55±3.45）％，聯(lián)用組與較TRAIL、SNP單藥組凋亡率

17、顯著提高，存在顯著性差異(P＜0.01)。同時且TRAIL與SNP聯(lián)用存在協(xié)同效應（協(xié)同因子=1.06），表明SNP可增強TRAIL對U251的凋亡作用。5 TRAIL、SNP及二者聯(lián)合應用對U251細胞Bcl-2、caspase-3、survivin、DR5蛋白的表達:Western blot結(jié)果顯示TRAIL作用24h后，與對照組相比，U251細胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達明顯降低，caspase-3蛋白表達明量顯增加，survivin表

18、達顯著升高，DR5表達量無明顯變化;SNP作用24h后，與對照組相比，U251細胞內(nèi)Bcl-2表達量明顯降低，caspase-3表達量無明顯變化，survivin表達量明顯降低，DR5蛋白表達量明顯增加;TRAIL與SNP聯(lián)合作用24h后，與對照組相比，Bcl-2蛋白表達量明顯降低，caspase-3表達量明顯增加，survivin表達量明顯降低，DR5表達量明顯增加，均與對照組存在顯著差異(P＜0.01)。表明TRAIL與SNP的協(xié)同

19、效應與腫瘤細胞內(nèi)上述四種蛋白的表達改變相關(guān)。
　　 結(jié)論:1TRAIL和SNP均可顯著抑制體外培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細胞株U251增殖，TRAIL與SNP聯(lián)用可增強對U251細胞的抑制作用。2SNP對U251細胞的生長抑制作用呈劑量依賴性，即隨著濃度的增高抑制作用增強。3 SNP對U251細胞的抑制依賴于其釋放的NO的生長抑制作用，并存在劑量依賴性，即隨著細胞內(nèi)NO濃度的增高細胞生長抑制率升高。4TRAIL和SNP均可誘導U251細胞凋亡