腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體與硝普鈉聯(lián)合誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand，TRAIL)是腫瘤壞死因子家族新成員，在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，對(duì)正常組織無(wú)明顯毒性，系統(tǒng)用藥時(shí)肝臟副作用小，對(duì)于包括腦膠質(zhì)瘤在內(nèi)的各種惡性腫瘤治療有良好的應(yīng)用價(jià)值和前景。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)不同腫瘤對(duì)于TRAIL作用的反應(yīng)性不一，約半數(shù)以上的腫瘤對(duì)TRAIL存在潛在

2、的和獲得性的耐藥，限制了抗腫瘤治療的臨床應(yīng)用。因此目前研究的重點(diǎn)在于尋找影響腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的反應(yīng)因素及腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的耐藥機(jī)制，從而提高TRAIL的抗腫瘤效應(yīng)。已有研究證實(shí)，TRAIL與各種抗腫瘤藥物、射線等其他因素聯(lián)合應(yīng)用能有效提高其抗腫瘤作用、克服腫瘤對(duì)TRAIL耐藥性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)許多藥物是TRAIL凋亡誘導(dǎo)作用的增敏劑，如細(xì)胞毒性藥物、小分子靶向藥物、干擾素等。這些藥物通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)源性和外源性凋亡信號(hào)、抑制抗凋亡因子、激活

3、促凋亡因子等途徑達(dá)到增強(qiáng)TRAIL對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用目的。目前，發(fā)現(xiàn)新的、有效的TRAIL凋亡誘導(dǎo)增敏劑，并探索其增敏作用的相關(guān)機(jī)制是TRAIL的抗腫瘤作用研究中的重要方向。一氧化氮(Nitric oxide，NO)是一種在生理和病理狀態(tài)下細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)因子，對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞均具有雙向凋亡調(diào)節(jié)作用。生理水平或更低水平的NO可促進(jìn)細(xì)胞抵抗某些凋亡誘導(dǎo)因素，而持續(xù)高濃度的NO可通過(guò)活化caspase蛋白酶家族，促進(jìn)細(xì)胞釋放細(xì)胞色素C

4、(Cytochrome C，CytC)，上調(diào)p53基因，改變凋亡相關(guān)蛋白如Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）是傳統(tǒng)的NO供體藥物，被廣泛用于NO相關(guān)的細(xì)胞生物學(xué)研究，有研究表明SNP可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制主要依賴(lài)于SNP釋放的活性分子NO，NO可激活細(xì)胞內(nèi)多種促凋亡分子，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)以人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，將SNP作為T(mén)RAIL誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡的增敏劑

5、，觀察TRAIL與SNP聯(lián)合作用對(duì)U251細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制的影響協(xié)同作用，研究不同濃度SNP對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡作用，并通過(guò)檢測(cè)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的調(diào)控蛋白的表達(dá)初步探討其可能的協(xié)同作用機(jī)制，以期為提高TRAIL體外抗腫瘤效應(yīng)，克服腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL耐藥的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)，從而為膠質(zhì)瘤的治療增添新的思路。
　　 方法:1細(xì)胞培養(yǎng):膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251在含10％胎牛血清(fetal bovineserum，F(xiàn)BS)的D

6、MEM/F12培養(yǎng)基中于37℃、5％C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2 TRAIL、SNP及二者聯(lián)合作用U251細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化:以TRAIL(800ng/ml)、SNP(0.5mM)單藥及二者聯(lián)合作用于U251細(xì)胞，于37℃、5％CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，于第12h、第24h用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。3 MTT法測(cè)定U251細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。3.1 TRAIL、SNP及二者聯(lián)合作用對(duì)U251細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期

7、的U251細(xì)胞，將TRAIL(800ng/ml)、SNP(0.5mM)及二者聯(lián)合作用于U251細(xì)胞24h，等量DMEM/F12培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，采用MTT比色法測(cè)定OD值并計(jì)算各組U251細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率％=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100％。3.2不同濃度SNP對(duì)U251細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞，將不同濃度SNP(0.2，0.5，1.0，1.5，2.0 mM)作用于U251細(xì)胞24h，等量DMEM/F12

8、培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，行MTT比色法測(cè)定測(cè)定每孔吸光度值（OD值），并計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率％=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100％。4 Griess法測(cè)定U251細(xì)胞內(nèi)NO含量:取Griess法細(xì)胞NO檢測(cè)試劑盒中的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)品，用DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋成不同濃度(0，1，2，5，10，20，40，60，100μM)，用Griess法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品NO含量并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以0.2，0.5，1.0，1.5，2.0 mM不同濃度

9、的SNP作用于U251細(xì)胞24h，用Griess法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)NO含量。5 AnnexinV-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)U251細(xì)胞凋亡率:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞，按分組予以不同處理因素:TRAIL組(800ng/ml)、SNP組(0.5mM)、聯(lián)合作用組（TRAIL濃度為800ng/ml+SNP濃度為0.5mM）、空白對(duì)照組（等量DMEM/F12培養(yǎng)基）作用24h，進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)，用Cell Quest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。認(rèn)

10、為Annexin V-FITC+PI+和Annexin V-FITC+PI-為凋亡細(xì)胞，每次計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算凋亡率。6 Western blot法測(cè)定U251細(xì)胞DR5、caspase-3、survivin、Bcl-2蛋白表達(dá):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以TRAIL(800ng/ml)、SNP(0.5mM)及二者聯(lián)合作用24h，以等量DMEM/F12培養(yǎng)基為空白對(duì)照，westernblot法測(cè)定各組細(xì)胞DR5、caspase-3、su

11、rvivin、Bcl-2、β-Actin表達(dá)，以β-Actin作為內(nèi)參照，用AlphaEase FC軟件分析，測(cè)定各組靶蛋白及內(nèi)參照蛋白的灰度值，以同一樣品中目的蛋白與內(nèi)參灰度值的比值作為蛋白的相對(duì)含量。7統(tǒng)計(jì)分析:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS19.0軟件分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:1倒置相差顯微鏡下U251細(xì)胞形態(tài)變

12、化:對(duì)照組U251細(xì)胞呈不規(guī)則梭形，突觸較多，折光度好，胞漿豐富，邊緣清晰，與培養(yǎng)板黏合緊密。TRAIL作用12h、24h后，見(jiàn)部分細(xì)胞變圓、縮小，折光度降低，黏附性降低，并隨著時(shí)間延長(zhǎng)，變化細(xì)胞數(shù)量增多。TRAIL與SNP聯(lián)合用藥作用24h后，可見(jiàn)大量細(xì)胞變圓、縮小、脫壁，邊緣毛糙，折光度降低，可見(jiàn)胞膜包裹的細(xì)胞碎片。2TRAIL、SNP與二者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251的生長(zhǎng)抑制作用:MTT法分別檢測(cè)TRAIL、SNP與二者聯(lián)合作

13、用對(duì)U251細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，結(jié)果顯示TRAIL(800ng/ml)作用24h后U251細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為(59.272±3.197)％，顯示出對(duì)U251細(xì)胞的顯著生長(zhǎng)抑制作用。SNP(0.5mM)作用24h后對(duì)U251細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為(35.467±3.091)％，對(duì)U251細(xì)胞同樣有生長(zhǎng)抑制作用，兩者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)U251細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為(77.425±1.702)％，較TRAIL單藥作用組和SNP單藥作用組顯著提高(F=351.

14、522，P=0.000)，組間存在顯著性差異(P＜0.01)。3用Griess法測(cè)定不同濃度SNP作用后細(xì)胞內(nèi)NO含量，①不同濃度(0.2 mM，0.5 mM，1.0 mM，1.5 mM，2.0mM)的SNP作用U251細(xì)胞內(nèi)NO含量分別為(0.708±0.070)％，(2.673±0.246)％，(4.587±0.770)％，(6.965±0.141)％，(10.931±0.827)％，隨著SNP濃度的增高，細(xì)胞內(nèi)NO含量遞增。不同濃

15、度(0.2 mM，0.5 mM，1.0 mM，1.5 mM，2.0mM)的SNP對(duì)U251細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為(12.913±3.700)％，(35.993±2.808)％，(50.117±3.131)％，(61.141±2.355)％，(74.468±2.259)％。顯示隨著SNP濃度的增高，U251細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率逐步遞增。②結(jié)合同濃度SNP對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，表明隨著NO濃度增高，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率升高，存在相關(guān)性(P＜0.01)。4

16、TRAIL、SNP及二者聯(lián)合誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TRAIL、SNP及二者聯(lián)用的細(xì)胞凋亡率，統(tǒng)計(jì)早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞所占比率，結(jié)果提示對(duì)照組凋亡率為(8.20±0.81)％，而SNP單藥作用凋亡率為(26.88±4.19)％，TRAIL單藥作用凋亡率為(36.87±3.69)％，均與對(duì)照組存在顯著差異(P＜0.01);TRAIL與SNP聯(lián)用時(shí)凋亡率上升至（67.55±3.45）％，聯(lián)用組與較TRAIL、SNP單藥組凋亡率

17、顯著提高，存在顯著性差異(P＜0.01)。同時(shí)且TRAIL與SNP聯(lián)用存在協(xié)同效應(yīng)（協(xié)同因子=1.06），表明SNP可增強(qiáng)TRAIL對(duì)U251的凋亡作用。5 TRAIL、SNP及二者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)U251細(xì)胞Bcl-2、caspase-3、survivin、DR5蛋白的表達(dá):Western blot結(jié)果顯示TRAIL作用24h后，與對(duì)照組相比，U251細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，caspase-3蛋白表達(dá)明量顯增加，survivin表

18、達(dá)顯著升高，DR5表達(dá)量無(wú)明顯變化;SNP作用24h后，與對(duì)照組相比，U251細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達(dá)量明顯降低，caspase-3表達(dá)量無(wú)明顯變化，survivin表達(dá)量明顯降低，DR5蛋白表達(dá)量明顯增加;TRAIL與SNP聯(lián)合作用24h后，與對(duì)照組相比，Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯降低，caspase-3表達(dá)量明顯增加，survivin表達(dá)量明顯降低，DR5表達(dá)量明顯增加，均與對(duì)照組存在顯著差異(P＜0.01)。表明TRAIL與SNP的協(xié)同

19、效應(yīng)與腫瘤細(xì)胞內(nèi)上述四種蛋白的表達(dá)改變相關(guān)。
　　 結(jié)論:1TRAIL和SNP均可顯著抑制體外培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251增殖，TRAIL與SNP聯(lián)用可增強(qiáng)對(duì)U251細(xì)胞的抑制作用。2SNP對(duì)U251細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用呈劑量依賴(lài)性，即隨著濃度的增高抑制作用增強(qiáng)。3 SNP對(duì)U251細(xì)胞的抑制依賴(lài)于其釋放的NO的生長(zhǎng)抑制作用，并存在劑量依賴(lài)性，即隨著細(xì)胞內(nèi)NO濃度的增高細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率升高。4TRAIL和SNP均可誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡