喹乙醇灌服前后小鼠不同組織中的基因表達(dá)差異研究.pdf

1、近年來，獸藥殘留的危害已成為一個(gè)世界范圍內(nèi)被高度關(guān)注的問題，因此，藥殘檢測方法的建立也就成了研究的熱點(diǎn)。但是現(xiàn)有的檢測方法多數(shù)存在著價(jià)格昂貴、操作繁瑣、靈敏度不高等問題。本研究以人工灌服小鼠喹乙醇為模型，利用差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR(DDRRT-PCR)技術(shù)尋找在灌服前后小鼠不同組織中差異表達(dá)的基因，試圖建立喹乙醇?xì)埩襞c基因表達(dá)之間的特異性關(guān)系，為建立分子生物學(xué)檢測手段奠定基礎(chǔ)。 首先提取健康昆明白雌性小鼠的肝臟、腎臟、卵巢，雄性小

2、鼠睪丸總RNA，利用設(shè)計(jì)合成的3’端錨定引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，然后再利用5’端隨機(jī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序膠SDS-PAGE，確定各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)，建立DDRT-PCR檢測技術(shù)。 選取昆明白小鼠60只，雌雄各半，在普通條件下飼養(yǎng)。將雌性和雄性鼠分別隨機(jī)分為2組，共4組。將雌鼠和雄鼠各取1組為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行灌服25mg/ml喹乙醇，每只35μl，另一組為對照組，灌胃同樣劑量的水，每天1次，連續(xù)灌服5天。同時(shí)取實(shí)驗(yàn)

3、組和對照組雌小鼠的肝、腎、卵巢，雄小鼠的睪丸，利用上述已建立的DDRT-PCR檢測技術(shù)尋找不同組織中差異表達(dá)的基因。分別在肝中發(fā)現(xiàn)8條差異基因，在腎中發(fā)現(xiàn)4條，在卵巢中發(fā)現(xiàn)1條，在睪丸中發(fā)現(xiàn)2條，共發(fā)現(xiàn)15條差異基因。對這些基因進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增后進(jìn)行序列測定，并與GenBank中小鼠的基因組基因或cDNA進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腎中差異表達(dá)的基因有3條為cDNA，分別命名為F1、F2、F3。根據(jù)F1、F2、F3的序列測定結(jié)果設(shè)計(jì)特異性引物

4、，對實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠的腎臟總RNA進(jìn)行特異性RF-PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，這三條基因在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)水平明顯高于對照組。 對F1、F2、F3進(jìn)行功能性分析，發(fā)現(xiàn)F1與蛋白磷酸酶1B基因同源性為100％。蛋白磷酸酶是一大類控制人體蛋白質(zhì)去磷酸化的關(guān)鍵酶，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用；F2與CCCH鋅指型結(jié)構(gòu)包含3個(gè)半胱氨酸、8個(gè)組氨酸(zc3h8)同源性為99％，鋅指是一種常出現(xiàn)在DNA結(jié)合蛋白中的一種結(jié)構(gòu)基元，具有鋅指結(jié)構(gòu)的蛋