喹乙醇灌服前后小鼠不同組織中的基因表達差異研究.pdf

1、近年來，獸藥殘留的危害已成為一個世界范圍內被高度關注的問題，因此，藥殘檢測方法的建立也就成了研究的熱點。但是現有的檢測方法多數存在著價格昂貴、操作繁瑣、靈敏度不高等問題。本研究以人工灌服小鼠喹乙醇為模型，利用差異顯示反轉錄PCR(DDRRT-PCR)技術尋找在灌服前后小鼠不同組織中差異表達的基因，試圖建立喹乙醇殘留與基因表達之間的特異性關系，為建立分子生物學檢測手段奠定基礎。 首先提取健康昆明白雌性小鼠的肝臟、腎臟、卵巢，雄性小

2、鼠睪丸總RNA，利用設計合成的3’端錨定引物進行反轉錄合成cDNA第1鏈，然后再利用5’端隨機引物進行PCR擴增，對擴增產物進行測序膠SDS-PAGE，確定各項技術參數，建立DDRT-PCR檢測技術。 選取昆明白小鼠60只，雌雄各半，在普通條件下飼養(yǎng)。將雌性和雄性鼠分別隨機分為2組，共4組。將雌鼠和雄鼠各取1組為實驗組進行灌服25mg/ml喹乙醇，每只35μl，另一組為對照組，灌胃同樣劑量的水，每天1次，連續(xù)灌服5天。同時取實驗

3、組和對照組雌小鼠的肝、腎、卵巢，雄小鼠的睪丸，利用上述已建立的DDRT-PCR檢測技術尋找不同組織中差異表達的基因。分別在肝中發(fā)現8條差異基因，在腎中發(fā)現4條，在卵巢中發(fā)現1條，在睪丸中發(fā)現2條，共發(fā)現15條差異基因。對這些基因進行二次PCR擴增后進行序列測定，并與GenBank中小鼠的基因組基因或cDNA進行比對，結果發(fā)現在腎中差異表達的基因有3條為cDNA，分別命名為F1、F2、F3。根據F1、F2、F3的序列測定結果設計特異性引物

4、，對實驗組和對照組小鼠的腎臟總RNA進行特異性RF-PCR擴增，結果表明，這三條基因在實驗組中的表達水平明顯高于對照組。 對F1、F2、F3進行功能性分析，發(fā)現F1與蛋白磷酸酶1B基因同源性為100％。蛋白磷酸酶是一大類控制人體蛋白質去磷酸化的關鍵酶，在信號轉導途徑中起關鍵調節(jié)作用；F2與CCCH鋅指型結構包含3個半胱氨酸、8個組氨酸(zc3h8)同源性為99％，鋅指是一種常出現在DNA結合蛋白中的一種結構基元，具有鋅指結構的蛋