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文檔簡介
1、Fosl2(Fos-like antigen2)屬于活化因子蛋白1(activator protein-1,AP1)轉(zhuǎn)錄因子家族中的一種,在多種組織中均有顯著表達(dá),對(duì)哺乳動(dòng)物的生長發(fā)育、生殖性狀、免疫應(yīng)答等方面起到重要的作用。近年來,隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)Fosl2基因與脂肪代謝、骨骼發(fā)育以及疾病和癌癥的發(fā)生有著重要聯(lián)系;Leptin基因是人們最早發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)能量代謝的基因。本研究在實(shí)驗(yàn)室前期工作的基礎(chǔ)上,以豫南黑豬為試驗(yàn)材料,對(duì)Fos
2、l2和Leptin進(jìn)行克隆測序及生物學(xué)信息分析,研究了豫南黑豬在不同發(fā)育時(shí)期及不同組織中的發(fā)育差異性表達(dá),以期探索Fosl2和Leptin在豬不同發(fā)育階段中所起的作用,從基因角度闡明豫南黑豬的組織表達(dá)譜規(guī)律。根據(jù)NCBI中GenBank已經(jīng)公布的人、鼠、牛和大猩猩Fosl2的mRNA序列,利用計(jì)算機(jī)軟件DNAstar進(jìn)行基因序列的同源性比對(duì),找出不同物種之間Fosl2基因cDNA的保守區(qū)域后設(shè)計(jì)特異性引物,采用RT-PCR技術(shù)克隆基因,
3、利用克隆的堿基序列作為探針在NCBI中進(jìn)行同源性比對(duì),利用生物信息學(xué)軟件對(duì)兩種基因的氨基酸結(jié)構(gòu)和序列特征進(jìn)行分析和預(yù)測,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法在mRNA水平上檢測兩種基因在豫南黑豬不同生長發(fā)育時(shí)期中的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉和背部脂肪組織中的表達(dá)變化和表達(dá)差異情況。通過上述方法得出如下試驗(yàn)結(jié)果:
1、根據(jù)不同物種比對(duì)后得到的保守區(qū)域,設(shè)計(jì)特異性引物,采用RT-PCR方法從豫南黑豬胎衣中擴(kuò)增出Fosl2基因部分cD
4、NA序列,從背部脂肪組織中擴(kuò)增出Leptin基因部分cDNA序列,分別為1427 bp和253bp;其中Fosl2的CDS區(qū)域長度為984 bp。
2、根據(jù)1中所示方法在豫南黑豬的內(nèi)臟器官中擴(kuò)增該基因序列時(shí),得到長度為770bp的Fosl2轉(zhuǎn)錄本。與胎衣中所得片段相比,該轉(zhuǎn)錄本第三外顯子后端缺失44個(gè)堿基序列,在第四外顯子的前端同樣有堿基缺失,長度為614 bp。
3、利用生物學(xué)信息軟件分析豫南黑豬Fosl2基因所得
5、序列與Leptin基因的CDS與多種物種的同源一致性,結(jié)果顯示:豬Fosl2基因序列與牛(NM_001192950.1)、人(BC022791.1)、獼猴(NM_001260911.1)、大猩猩(XM_004029036.1)、鼠(XM_004686333.1)、樹鼩(XM_006162129.1)、馬(XM_005600106.1)的核苷酸同源性分別為91%、89%、89%、89%、89%、88%、90%。而與上述物種的氨基酸一致性則
6、分別為:85%、86%、84%、85%、82%、83%、71%??梢娫摶蛟诓煌锓N之間的保守性較高。Leptin基因與人(NM_000230.2)、牛(NM_173928.2)、鼠(NM_013076.3)、海豹(AJ618981.1)、海獅(AM157372.2)、犬(NM_001003070.1)、灰海豹(AJ618982.1)、小家鼠(NM_008493.3)、獼猴(NM_001042755.1)、家貓(NM_001009850
7、.1)等物種核苷酸同源性分別為88%、92%、85%、83%、87%、92%、83%、85%、88%、91%,而與上述物種的氨基酸一致性分別為97%、100%、94%、89%、87%、90%、92%、94%、97%、92%,該基因在哺乳動(dòng)物間的保守型同樣較高。
4、通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測到豫南黑豬Fosl2基因在多種組織內(nèi)廣泛表達(dá),其中在7日齡、30日齡、60日齡和180日齡中肺臟組織中的相對(duì)表達(dá)含量雖有較大波動(dòng),但一
8、直維持在最高的相對(duì)表達(dá)水平,其次是在脾臟組織內(nèi)的相對(duì)表達(dá)含量。而Leptin基因在180日齡中的脂肪組織內(nèi)相對(duì)表達(dá)含量最高。
5、兩種基因在同一組織的不同發(fā)育時(shí)期的變化規(guī)律為:肺臟組織中Fosl2基因的mRNA變化幅度最大,7日齡肺臟、腎臟和脾臟內(nèi)的相對(duì)表達(dá)含量為各個(gè)時(shí)期的最高值,30日齡的肌肉組織內(nèi)相對(duì)表達(dá)含量最高,180日齡時(shí)心臟和背部脂肪內(nèi)Fosl2基因的相對(duì)表達(dá)含量最高。Leptin基因在7日齡腎臟和肌肉內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量
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