膿毒癥中內(nèi)皮細(xì)胞損傷與器官損害及全身病情變化間關(guān)系的研究.pdf

1、現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展使許多以前難以開(kāi)展的臨床高難診治技術(shù)得以實(shí)施，許多嚴(yán)重疾患病人因此得以存活，但危重病例比如膿毒癥(sepsis)的發(fā)病率也因此日漸增加。由于目前膿毒癥的治療措施尚無(wú)顯著進(jìn)展，只有早期診斷、早期治療才有助于降低其死亡率。內(nèi)皮細(xì)胞既是膿毒癥中的效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞，又在機(jī)體正常生理的維持中扮演著重要角色。因此，我們推測(cè)反映內(nèi)皮細(xì)胞損傷的指標(biāo)能間接反映膿毒癥中組織的損傷和炎癥輕重程度。在檢測(cè)臨床常規(guī)臟器功能指標(biāo)的基礎(chǔ)上，監(jiān)測(cè)內(nèi)皮

2、細(xì)胞狀態(tài)可望能更早、更敏感地判斷機(jī)體臟器綜合狀況。而目前已有的評(píng)價(jià)內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度的指標(biāo)都存在不同程度的不足之處。 目的： 本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)在膿毒癥動(dòng)物模型中檢測(cè)血液中循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(circulatingendothelial cells，CECs)數(shù)量、內(nèi)皮細(xì)胞特異性基因mRNA含量和臟器血管通透性、組織含水量來(lái)綜合反映內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度。同時(shí)觀察主要臟器組織學(xué)和功能的變化。分析內(nèi)皮細(xì)胞損傷與重要臟器功能間的關(guān)系。并在動(dòng)物實(shí)

3、驗(yàn)的基礎(chǔ)上，初步研究臨床膿毒癥患者內(nèi)皮細(xì)胞損傷與全身病情變化的關(guān)聯(lián)。 方法： 1、大鼠膿毒癥模型的制作及一般評(píng)價(jià)：90只大鼠分為6組，正常對(duì)照組，假手術(shù)(sham)組，盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)3h組，CLP6h組，CLP12h組和CLP24h組，每組15只。CLP大鼠結(jié)扎盲腸全長(zhǎng)，16號(hào)針頭穿孔3個(gè)；sham組僅做剖腹術(shù)。36只大鼠(每組6只)鼠尾采血計(jì)數(shù)術(shù)前、術(shù)后全

4、血白細(xì)胞數(shù)量；術(shù)后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)采集血清ELISA法檢測(cè)IL-6含量。 2、大鼠CLP后內(nèi)皮細(xì)胞損傷的檢測(cè)：36只大鼠(每組6只)CLP術(shù)后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)采血應(yīng)用密度梯度分離法分離、計(jì)數(shù)CECs。36只大鼠(每組6只)術(shù)后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)采血提取全血RNA，熒光實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞特異性基因tie2、vegfr2的mRNA含量。應(yīng)用伊文思蘭法和干濕比重法檢測(cè)18只(每組3只)大鼠心臟、肝臟、腎臟、回腸、肺臟

5、組織的血管通透性和組織含水量變化。 3、大鼠CLP后主要臟器功能變化的評(píng)價(jià)及其與內(nèi)皮細(xì)胞損傷的關(guān)聯(lián)分析：應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)36只大鼠(每組6只)K<'+>、Na<'+>、Cl<'->、AST、ALT、BUN和Cr的水平。同時(shí)HE染色觀察心臟、肝臟、腎臟、回腸、肺臟的病理組織學(xué)變化。比較血循環(huán)中tie2、vegfr2的mRNA含量與上述生化分析指標(biāo)的相關(guān)性。 4、膿毒癥患者內(nèi)皮細(xì)胞損傷與病情變化的關(guān)聯(lián)分析：選擇重癥監(jiān)

6、護(hù)病房(intensivecare unit，ICU)的創(chuàng)傷患者，分為膿毒癥組和非膿毒癥組，在收入ICU的第1、3、7、14、21、28天采血提取全血RNA，real-time PCR檢測(cè)血循環(huán)中tie2的mRNA含量。同時(shí)應(yīng)用ELISA法檢測(cè)血漿vwF的含量。分別分析tie2 mRNA含量與APACHEⅡ評(píng)分、vwF含量的關(guān)系。同時(shí)檢測(cè)血白細(xì)胞總數(shù)、AST、ALT、BUN和Cr的水平，并將之與tie2 mRNA含量比較。 結(jié)果

7、： 1、大鼠膿毒癥模型的一般評(píng)價(jià)：大鼠CLP后24小時(shí)死亡率為31.82％(7/22)。正常對(duì)照和sham組的白細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著差異。CLP3h組白細(xì)胞數(shù)量顯著升高(P<0.05)，之后逐漸下降。與正常對(duì)照組比較，CLP組IL-6水平隨時(shí)間持續(xù)增長(zhǎng)，但直到CLP后6h時(shí)IL一6增高幅度才具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，12h組、24h組IL-6水平進(jìn)一步增加(P<0.01)。 2、CLP后內(nèi)皮細(xì)胞傷情的評(píng)價(jià)：與正常對(duì)照比較

8、，CEC數(shù)量在CLP后3h達(dá)到峰值(P<0.05)，隨后逐漸下降，CLP24h組CEC數(shù)量明顯低于3h、6h組(P<0.05)。CLP3h組循環(huán)血內(nèi)皮細(xì)胞特異性基因tie2 mRNA含量顯著高于正常對(duì)照和CLP其余時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)，但vegfr2 mRNA水平在正常對(duì)照和CLP組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。CLP后3h，大鼠心，肺的血管通透性明顯增加(P<0.05)，CLP后6h觀察到肝臟血管通透性的增加(P<0.05)。直到傷

9、后12h腎臟的血管通透性才發(fā)生顯著變化(P<0.05)。在傷后12到24h各臟器的血管通透性一直維持在較高水平(P<0.05)。CLP后3h，大鼠心、腎組織含水量增高(P<0.05)，12h時(shí)肝臟組織含水量上升(P<0.05)。 3、大鼠CLP后主要臟器功能變化的評(píng)價(jià)：CLP后肝細(xì)胞充血、變性。CLP后3h出現(xiàn)局灶性肺不張，肺泡內(nèi)紅細(xì)胞滲出，并且不斷加重?；啬c黏膜充血、壞死、脫落。腎小球充血，小管內(nèi)可見(jiàn)脫落的上皮細(xì)胞。心肌可見(jiàn)局

10、灶性出血。與正常對(duì)照比較，AST、ALT和BUN分別在CLP6h和CLP12h出現(xiàn)顯著增加(P<0.05)。血清K<'+>、Na<'+>、Cl<'->在CLP后有不同程度的升高(P<0.05)。 4、膿毒癥患者內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度與全身病情變化的關(guān)聯(lián)分析：膿毒癥組tie2mRNA含量顯著高于非膿毒癥組(p<0.01)?；颊叩腁PACHE Ⅱ評(píng)分與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)血循環(huán)中tie2 mRNA含量呈高度正相關(guān)(p<0.01)，Peason's相

11、關(guān)系數(shù)r=0.532(P<0.01)。其線形擬合方程為Y=12.66+4.922X(R<'2>=0.283)。血漿vwF含量在兩組患者間無(wú)顯著差異(P>0.05)，但與循環(huán)tie2 mRNA水平顯著正相關(guān)(P<0.05)，Peason's相關(guān)系數(shù)r=0.334.(p<0.05)。其線形擬合方程為Y=180.932+57.93X(R<'2>=0.112)。膿毒癥組全血白細(xì)胞總數(shù)顯著高于非膿毒癥組(P<0.01)。膿毒癥組的BuN和cr值也

12、顯著高于非膿毒癥組(P<0.01)。AsT和ALT在兩組間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。 結(jié)論：1、本試驗(yàn)制作的CLP膿毒癥模型為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供了可靠的模型基礎(chǔ)。 2、CLP后內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行性損傷，表現(xiàn)為CECs數(shù)量和血液中tie2 mRNA含量增高，各主要臟器血管通透性增高，組織含水量增加。Real-time PCR檢測(cè)tie2 mRNA能靈敏反映內(nèi)皮細(xì)胞的損傷程度。 3、CLP后大鼠主要臟器組織學(xué)水平進(jìn)行性損傷