清火敗毒飲通過HSP70拮抗燒傷后腸粘膜凋亡機制研究.pdf

1、目的:在動物體內和體外研究清火敗毒飲對燒傷后腸粘膜組織中Hsp70/p-Akt通路表達水平及凋亡相關因子Caspase-3的影響，探討上述因素對燒傷后腸粘膜可能的保護機制。
　　方法:選擇健康SD大鼠136只，隨機分為正常組（又稱對照組）、單純燒傷組（簡稱燒傷組）、燒傷后QHBDY治療組（簡稱治療組），治療組根據(jù)清火敗毒飲灌喂劑量不同分為0.5ml/100g，1ml/100g，1.5ml/100g三組。于燒傷后6小時，12小時，2

2、4小時以及48小時采集小腸組織標本，用TUNEL法分析小腸粘膜組織細胞的凋亡率，運用Real time PCR技術和IHC技術檢測腸粘膜組織中Hsp70、Caspase-3的表達情況。構建Hsp70-pZsGreen卜C1真核表達載體，將其轉染入IEC-18細胞，用Western blot的方法觀察轉染后12小時，24小時，48小時和72小時Hsp70和p-Akt的表達情況。用FCM術檢測Hsp70轉染后對細胞凋亡率的影響，用Caspa

3、se-3分光光度法檢測Hsp70轉染后對細胞Caspase-3活性的影響。在細胞水平的研究先對燒傷血清的濃度和藥物濃度以及處理時間進行了摸索，根據(jù)細胞存活率確定最佳濃度和處理時間。分別用燒傷血清和（或）中藥對細胞進行干預，用FCM術檢測干預后細胞凋亡率的變化，用Caspase-3分光光度法檢測干預后細胞Caspase-3活性的變化，用Western blot的方法檢測在燒傷血清和藥物的共同作用下Hsp70的表達情況。
　　結果:燒

4、傷后SD大鼠小腸粘膜細胞的凋亡率明顯增加。1ml/100g和1.5ml/100g治療組的凋亡率比燒傷組低。燒傷后SD大鼠小腸粘膜組織中Hsp70在mRNA水平和蛋白水平的表達均增加，Caspase-3在蛋白水平的表達增加。1.5ml/100g治療組與燒傷組相比，Hsp70和Caspase-3在蛋白水平的表達均存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。細胞轉染后，p-Akt蛋白表達隨Hsp70蛋白表達的增加而增加，兩者呈正相關。而Caspase-3

5、的相對活性和細胞凋亡率降低。MTT的結果顯示，燒傷血清和清火敗毒飲對IEC-18細胞存活率的影響均存在濃度效應和時間效應。在燒傷血清和清火敗毒飲共同作用下，與燒傷血清組相比，凋亡相關因子Caspase-3蛋白相對活性降低，凋亡率也降低。Western blot相對定量結果顯示，治療組與燒傷血清組相比，Hsp70的表達增加。
　　結論:燒傷后腸粘膜中Hsp70在mRNA水平和蛋白水平的表達均增加，發(fā)揮應激保護作用。清火敗毒飲可能通過