HP／LP-PRRSV二重FQ-PCR診斷方法的建立及其Nsp2和ORF5基因變異分析.pdf

1、2006年以來，我國大部分地區(qū)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（HP-PRRS）與低致病性豬繁殖與呼吸綜合征（LP-PRRS）混合感染并流行，其Nsp2和ORF5基因的不斷變異也增加了控制這兩種疫病的難度，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，針對(duì)這兩種病原的診斷方法費(fèi)時(shí)、耗力，而且難以鑒別診斷，其Nsp2和ORF5基因遺傳進(jìn)化規(guī)律難以掌握。為了對(duì)HP-PRRS和LP-PRRS進(jìn)行快速、可靠的鑒別診斷，了解河南省2010～2012年 PRR

2、SV的流行動(dòng)態(tài)及主要基因遺傳變異情況，本研究進(jìn)行了 HP/LP-PRRSV二重實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR（fluorescent quantitative real-time PCR, FQ-PCR）診斷方法的建立，并對(duì)PRRSV的Nsp2和ORF5基因進(jìn)行了克隆測(cè)序與遺傳進(jìn)化分析。
　　比對(duì)GenBank中登錄的HP-PRRSV和LP-PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白（Nsp2）基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan MGB熒光探針，經(jīng)優(yōu)化

3、反應(yīng)條件，建立起鑒別HP/LP-PRRSV二重FQ-PCR檢測(cè)方法；分別對(duì)該方法進(jìn)行二重FQ-PCR檢測(cè)方法的敏感性、特異性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，并對(duì)疑似PRRSV感染臨床樣品進(jìn)行了應(yīng)用檢測(cè)，同時(shí)與HP/LP-PRRSV二重RT-PCR方法進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)；選擇本方法檢測(cè)出的有代表性的PRRSV陽性樣品，對(duì)其Nsp2和ORF5基因進(jìn)行擴(kuò)增和克隆，并進(jìn)行序列測(cè)定和遺傳進(jìn)化分析。
　　結(jié)果顯示，成功建立了鑒別 HP/LP-PRRSV的二重 FQ-

4、PCR檢測(cè)方法， HP/LP-PRRSV標(biāo)準(zhǔn)曲線的曲線循環(huán)閾值與模板濃度具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.998和0.997；該方法靈敏度可達(dá)101copies/μL；特異性高， HP/LP-PRRSV陽性對(duì)照呈現(xiàn)陽性反應(yīng)曲線，而對(duì)5個(gè)對(duì)照病原擴(kuò)增曲線均呈現(xiàn)陰性反應(yīng)；不同濃度的HP/LP-PRRSV重組質(zhì)粒分別重復(fù)擴(kuò)增3次，重復(fù)結(jié)果良好；對(duì)25份臨床疑似PRRSV感染樣品進(jìn)行了應(yīng)用檢測(cè)，陽性檢出率為92％，較二重RT-PCR方法陽性

5、檢出率高。對(duì)8個(gè)臨床代表性陽性樣品進(jìn)行Nsp2基因和ORF5基因片段克隆和測(cè)序分析，序列分析結(jié)果表明樣品之間Nsp2基因核苷酸同源率為93.5%～98.0%，與VR-2332核苷酸同源率為82.8%～83.7%，LV毒株獨(dú)成一分支，表明Nsp2核苷酸同源率較高，均屬于美洲型毒株；與JXA1株核苷酸同源性94.5～97.3%，同在JXA1代表的大分支上，同HPRRSV同樣均缺失30氨基酸；ORF5基因核苷酸之間同源率為93.9%～98.2