PRRSV ORF2a和NSP2部分缺失毒株的分離及生長(zhǎng)特性的研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)俗稱(chēng)豬藍(lán)耳病，該病病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS virus，PRRSV)，臨床以妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、弱胎、木乃伊胎等繁殖障礙表現(xiàn)、不同年齡豬只呼吸系統(tǒng)疾病和高死亡率為主要特征。自1987年爆發(fā)以來(lái)，給世界范圍內(nèi)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)于1996年首次爆發(fā)該病，迅速蔓延全國(guó)，成為我國(guó)豬繁殖障礙疾病的

2、主要病原。2006年，我國(guó)爆發(fā)以高熱（≧41°）、高發(fā)病率(50-100％)和高死亡率(20-100％)為特征的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(HP-PRRS)，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。至今，HP-PRRS仍是危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的頭號(hào)疫病。由于PRRSVRNA聚合酶的保證性較低，造成病毒復(fù)制過(guò)程中非常容易發(fā)生RNA錯(cuò)配和抗原漂移，導(dǎo)致產(chǎn)生大量變異毒株，影響PRRS的防控。因此及時(shí)監(jiān)測(cè)PRRSV在我國(guó)規(guī)?；i場(chǎng)中的流行和變異情況，對(duì)有效防控PR

3、RS具有十分重要的指導(dǎo)意義。
　　為研究PRRSV在規(guī)?；瘓?chǎng)的感染情況及遺傳演化規(guī)律，本研究共采集某豬場(chǎng)具有PRRS疑似癥狀的754份血清和21份死亡仔豬的肺臟進(jìn)行血清抗體檢測(cè)，病毒分離鑒定，基因序列分析和特征毒株的生物學(xué)特性研究。
　　病原學(xué)和血清學(xué)檢測(cè)表明，該豬場(chǎng)PRRSV抗體陽(yáng)性率達(dá)到91.9％，公豬、母豬、哺乳仔豬和育肥豬的抗體陽(yáng)性率分別為100％(7/7)、97.38％（149/153）、98.04％(201/20

4、5)和95.08％(115/120)。斷奶仔豬、后備母豬和育成豬的抗體陽(yáng)性率分別為83.55％、81.82％和80％。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)從775份樣品中確定104份樣品為PRRSV陽(yáng)性，為了排除陽(yáng)性樣品中的疫苗毒株，利用疫苗毒株在豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)上連續(xù)傳代2代后就不再?gòu)?fù)制的特性，將104份陽(yáng)性樣品全部接種PAM并盲傳5代，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)分離出34份PRRSV野毒株。序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)34個(gè)樣品中存存14個(gè)野毒株。
　　

5、全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，14個(gè)毒株的核苷酸同源性從95.2％-99.5％，平均同源率存96％左右，平均差異度達(dá)3.44％，毒株間最大差異為4.7％，最小差異0.5％。NSP2基因分析表明，A1-A1313個(gè)毒株均在NSP2的481位缺失1個(gè)氨基酸，533-561位缺失29個(gè)氨基酸，完全符合HP-PRRSV30個(gè)不連續(xù)氨基酸缺失的分子特征;Henan-A14除了533-561存在29個(gè)氨基酸缺失外，其472-520位還存在48個(gè)氨基酸的缺失

6、。上述結(jié)果表明14個(gè)分離毒株均為HP-PRRSV。將14株病毒與GeneBank中62個(gè)不同時(shí)期分離的美洲型PRRSV代表毒株分析發(fā)現(xiàn)，76個(gè)PRRSV可分為六個(gè)亞群，1、2亞群為經(jīng)典PRRSV毒株，3、4、5、6亞群主要為HP-PRRSV毒株。本研究分離的14株病毒處于3個(gè)亞群，分為2個(gè)明顯不同的進(jìn)化方向。其中，A1位于5亞群，A3-4，A9-148個(gè)毒株處于親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的6亞群，A2，A5-85個(gè)毒株處于3亞群。
　　分離毒株

7、的細(xì)胞嗜性和抗原性研究表明，14個(gè)毒株均能在PAM細(xì)胞上生長(zhǎng)復(fù)制，與強(qiáng)毒HuN4株相比，2株病毒的復(fù)制能力增強(qiáng)，1株病毒的復(fù)制能力下降。與此相反，5株病毒不能在MARC-145細(xì)胞中復(fù)制，3株病毒在MARC-145細(xì)胞上的復(fù)制能力顯著降低，與之前的研究結(jié)果存在顯著差異，表明分離毒株的細(xì)胞嗜性發(fā)生較大改變，可能對(duì)今后弱毒疫苗的研制和病毒分離制造困難。以HuN4疫苗株制備的血清在PAM上對(duì)分離毒株進(jìn)行中和試驗(yàn)，評(píng)估分離毒株的中和抗原是否發(fā)生

8、改變。結(jié)果表明，4株病毒的中和抗原與HuN4存在巨大差異，高免血清不能中和這些毒株，5株病毒的中和效價(jià)比HuN4顯著降低，說(shuō)明分離毒株的中和抗原與HuN4疫苗毒株存在較大差異，可能會(huì)影響疫苗免疫的保護(hù)效果。
　　序列分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)毒株基因組中ORF2a的246位氨基酸的密碼子TTA突變?yōu)榻K止密碼子TAA，導(dǎo)致其編碼的GP2蛋白的C末端提前終止，其編碼的蛋白大小由正常的256個(gè)氨基酸縮短為246個(gè)氨基酸。1個(gè)毒株的NSP2區(qū)除了缺失

9、29個(gè)氨基酸之外，還缺失48個(gè)氨基酸。上述3個(gè)毒株的生物學(xué)特性和抗原性均發(fā)生了改變:ORF2a缺失毒株不能在MARC-145細(xì)胞上生長(zhǎng)復(fù)制，NSP2缺失毒株在該細(xì)胞的復(fù)制能力顯著下降。此外，這3株病毒對(duì)HuN4高免血清的中和效價(jià)發(fā)生較大變化，1株病毒不能中和，2株病毒的中和效價(jià)顯著降低。為了研究ORF2a和GP2部分缺失對(duì)其細(xì)胞嗜性和抗原性的影響，以感染性克隆rHuN4-F112為骨架，分別拯救出ORF2a和GP2部分缺失的重組病毒rH

10、uN4-F112-ΔGP2和rHuN4-F112-D48，分別在MARC-145細(xì)胞上對(duì)其生長(zhǎng)特性及中和抗原進(jìn)行分析。結(jié)果表明，重組病毒rHuN4-F112-ΔGP2的生長(zhǎng)特性和中和效價(jià)與親本毒株rHuN4-F112沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明GP2C末端10個(gè)氨基酸的缺失，不影響重組病毒在MARC-145細(xì)胞上的生長(zhǎng)復(fù)制，也不改變重組病毒的中和抗原。對(duì)重組病毒rHuN4-F112-D48的研究表明，重組病毒rHuN4-F112-D48的生長(zhǎng)特性

11、和中和效價(jià)與親本毒株rHuN4-F112沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明NSP2高變區(qū)48個(gè)氨基酸的缺失，不影響重組病毒在MARC-145細(xì)胞上的生長(zhǎng)復(fù)制，也不改變重組病毒的中和抗原。以上結(jié)果與基因缺失毒株的生物學(xué)特性結(jié)果截然相反，說(shuō)明基因缺失毒株的生物學(xué)特性的改變，需要進(jìn)行進(jìn)一步研究和探討。
　　本研究在一個(gè)豬場(chǎng)分離出屬于3個(gè)基因亞群的14株HP-PRRSV，發(fā)現(xiàn)分離毒株對(duì)MARC-145的細(xì)胞嗜性發(fā)生改變，與HuN4疫苗株的中和抗原存在較大