黃酮類化合物庫(kù)內(nèi)小分子4a經(jīng)曲PPAr-β-Mfn2-[Ca2+]m 信號(hào)調(diào)控胚胎干細(xì)胞神經(jīng)分化.pdf

1、小鼠胚胎干(embryonic stem，ES)細(xì)胞具有自我更新和多分化潛能，合適的微環(huán)境可使ES細(xì)胞體外分化成神經(jīng)外胚層組織，進(jìn)而定向分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。ES細(xì)胞體外神經(jīng)分化模型可模擬體內(nèi)胚胎神經(jīng)發(fā)育過(guò)程，通過(guò)活性小分子化合物體外干預(yù)ES細(xì)胞微環(huán)境，可以為設(shè)計(jì)和評(píng)價(jià)神經(jīng)分化調(diào)控藥物提供新的平臺(tái)。同時(shí)該小分子作為探針可以發(fā)揮在不同時(shí)間、不同劑量和進(jìn)行可逆操作方式的優(yōu)勢(shì)來(lái)檢測(cè)特定蛋白的功能，從而探查發(fā)現(xiàn)ES細(xì)胞神經(jīng)分化新的分子事件

2、和信號(hào)通路，在基因（蛋白）功能研究、藥物作用新靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)與確證以及新藥先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)中具有巨大的潛力。利用小分子化合物深入闡明ES細(xì)胞神經(jīng)分化機(jī)制，也為揭示體內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)分化發(fā)育網(wǎng)絡(luò)和神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)理提供新的思路和理論依據(jù)。
　　本課題前期研究發(fā)現(xiàn)一些天然8位異戊烯基取代黃酮類化合物，如淫羊藿素（icaritin，ICT）和異補(bǔ)骨脂甲素(isobavachin，IBA)具有促小鼠ES細(xì)胞神經(jīng)分化作用。據(jù)此利用組合化學(xué)手段，建

3、立了具有黃酮類母核小分子化合物庫(kù)。并選擇其中母核不同位置異戊烯基取代的化合物庫(kù)內(nèi)小分子，通過(guò)評(píng)價(jià)化合物促P19胚胎癌（embryonal carcinoma，EC）細(xì)胞軸突生長(zhǎng)（細(xì)胞骨架蛋白）和囊泡攝取功能活性篩選，初步發(fā)現(xiàn)小分子化合物4a具有促神經(jīng)分化活性。基于初步篩選結(jié)果進(jìn)一步在ES細(xì)胞中評(píng)價(jià)確認(rèn)（次級(jí)篩選），才能確認(rèn)活性化合物。因此本文在第一部分進(jìn)一步采用小鼠ES細(xì)胞體外分化神經(jīng)元模型，以神經(jīng)骨架蛋白表達(dá)和囊泡攝取功能為指標(biāo)，評(píng)價(jià)

4、黃酮類化合物4a的促神經(jīng)分化作用，并初步探索細(xì)胞分裂活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)信號(hào)通路在其中的作用。
　　神經(jīng)元是可興奮細(xì)胞，具有高能量需求，用于維持基本生命活動(dòng)。線粒體是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ATP的主要細(xì)胞器，為生命活動(dòng)提供能量來(lái)源。神經(jīng)元本身儲(chǔ)存ATP很有限。線粒體能量代謝發(fā)生障礙已成為缺血性腦損傷和神經(jīng)退行性疾病公認(rèn)的早期病理現(xiàn)象，長(zhǎng)期腦能量供應(yīng)不足，是神經(jīng)元功能下降和

5、死亡的重要原因。線粒體在神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)突起生長(zhǎng)和維持神經(jīng)可塑性中也有重要作用，因此本研究第二部分考察了ES細(xì)胞定向分化神經(jīng)元過(guò)程線粒體發(fā)生分布、線粒體膜電位（Ψm）變化及能量代謝方式，探索化合物4a調(diào)控線粒體能量代謝與促ES細(xì)胞神經(jīng)分化相關(guān)性。并在第三部分探索了化合物4a促小鼠ES細(xì)胞分化為神經(jīng)元的內(nèi)在分子機(jī)制，著重探索與能量發(fā)生系統(tǒng)密切相關(guān)的過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisomeproliferator-activated

6、receptors，PPARs)在其中所扮演的角色，并對(duì)上下游分子事件和信號(hào)通路，如β-連環(huán)蛋白(β-catenin)/T細(xì)胞因子(T cell factor，TCF)、Mfn2和線粒體Ca2+進(jìn)行了深入探索。
　　1.黃酮類化合物庫(kù)內(nèi)小分子4a促ES細(xì)胞神經(jīng)分化研究
　　利用小鼠ES細(xì)胞體外分化神經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)體系，以神經(jīng)特異性骨架蛋白和囊泡攝取功能為指標(biāo)評(píng)價(jià)黃酮類化合物4a的促神經(jīng)分化活性，并初步探索MAPK信號(hào)通路在其中的

7、作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)10-7 mol/L化合物4a共孵育，能促小鼠ES細(xì)胞體外分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，顯著提高分化所得細(xì)胞中神經(jīng)元比例，并上調(diào)神經(jīng)特異性蛋白巢蛋白(Nestin)，微管蛋白(β-tubulinⅢ)，神經(jīng)絲蛋白(Neurofilament，NEFM)和突觸素(synaptophysin)的表達(dá)量。FM1-43FX熒光結(jié)果顯示，化合物4a能提高ES衍生神經(jīng)元的囊泡攝取功能。ERK1/2磷酸化參與化合物4a促神經(jīng)分化過(guò)程，采用MEK抑制

8、劑U0126(10-5 M)預(yù)處理細(xì)胞后，可顯著抑制化合物4a促神經(jīng)分化作用。上述結(jié)果提示，化合物4a促小鼠ES細(xì)胞神經(jīng)分化伴有提高神經(jīng)特異性蛋白表達(dá)和突觸囊泡攝取功能，MEK-ERK1/2通路參與此過(guò)程。
　　2.化合物4a調(diào)控線粒體能量代謝與促ES細(xì)胞神經(jīng)分化相關(guān)性
　　本部分實(shí)驗(yàn)從線粒體發(fā)生分布、線粒體膜電位（Ψm）變化及能量代謝方式角度，探索了黃酮類化合物4a促小鼠ES細(xì)胞體外分化為神經(jīng)元的內(nèi)在作用機(jī)制。
　　

9、首先采用活細(xì)胞線粒體熒光染料MitoTracker Red與不同分化階段細(xì)胞特異性蛋白雙染，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是ES細(xì)胞，還是化合物4a誘導(dǎo)的神經(jīng)前體細(xì)胞和神經(jīng)元均有線粒體分布，且在神經(jīng)前體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)線粒體引領(lǐng)軸突生長(zhǎng)現(xiàn)象，這與化合物4a能增加cAMP含量相關(guān)。其次用JC-1染色考察線粒體Ψm變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物4a能促使神經(jīng)分化中線粒體綠色熒光向紅色熒光轉(zhuǎn)變，提示神經(jīng)分化過(guò)程中，Ψm逐漸趨于正常，神經(jīng)元分化與線粒體Ψm維持呈良好的相關(guān)性。

10、>　　神經(jīng)前體細(xì)胞中相關(guān)能量代謝指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果表明，化合物4a提高了細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗速率，但無(wú)顯著性差異;化合物4a能顯著提高神經(jīng)分化早期與線粒體呼吸相關(guān)的氧氣消耗率OCR值，并降低與糖酵解相關(guān)的胞外酸化率ECAR值。同時(shí)，化合物4a也降低了乳酸產(chǎn)率和乳酸脫氫酶活力。化合物4a降低細(xì)胞ATP含量可能與產(chǎn)生的ATP被高能量需求的神經(jīng)前體細(xì)胞消耗有關(guān)。線粒體Ca2+特異性染料Rhod-2檢測(cè)結(jié)果表明4a能調(diào)節(jié)神經(jīng)前體細(xì)胞線粒體Ca2+瞬變

11、功能，從而維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)ATP產(chǎn)生。Rhod-2和Mito green的共染結(jié)果表明化合物4a能提高神經(jīng)前體細(xì)胞線粒體Ca2+濃度。電鏡結(jié)果也表明，化合物4a組神經(jīng)前體細(xì)胞中確實(shí)存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體相互作用。
　　綜上所述，化合物4a能通過(guò)促進(jìn)線粒體成熟和維持Ψm正常水平，調(diào)整線粒體分布，促神經(jīng)分化早期細(xì)胞能量代謝方式轉(zhuǎn)變以滿足細(xì)胞神經(jīng)分化的能量需求，從而發(fā)揮促小鼠ES細(xì)胞神經(jīng)分化作用。
　　3.化合物4a經(jīng)由P

12、PAR-β-Mfn2-[Ca2+]M調(diào)控線粒體能量代謝促ES細(xì)胞神經(jīng)分化
　　本部分探索了化合物4a促小鼠ES細(xì)胞分化為神經(jīng)元時(shí)的內(nèi)在分子機(jī)制，著重探索PPARs在其中所扮演的角色，并對(duì)上下游分子事件和信號(hào)通路，如β-catenin/TCF、Mfn2和線粒體Ca2+進(jìn)行了深入探索。
　　PPARs家族蛋白與線粒體能量發(fā)生系統(tǒng)密切相關(guān)。本研究結(jié)果相繼論證:(1)免疫熒光雙染結(jié)果顯示，PPAR-β與神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志物Nestin

13、和神經(jīng)元標(biāo)記物β-tubulinⅢ共疊加。(2)PPAR-β蛋白表達(dá)水平隨著化合物4a促神經(jīng)分化顯著上調(diào)，并激活靶基因ACS2。(3)加入PPAR-β拮抗劑GSK0660嚴(yán)重影響化合物4a誘導(dǎo)的神經(jīng)分化，但對(duì)RA的促神經(jīng)分化作用不影響。(4)干擾PPAR-β可抑制化合物4a促神經(jīng)分化作用。上述結(jié)果綜合表明，PPAR-β確實(shí)參與化合物4a促小鼠ES細(xì)胞神經(jīng)分化過(guò)程，并且在神經(jīng)分化早期就起作用，該作用機(jī)制與RA截然不同。PPAR-β可能作為

14、分子開(kāi)關(guān)，調(diào)控神經(jīng)前體細(xì)胞中線粒體功能改變，從而發(fā)揮化合物4a促神經(jīng)分化作用。
　　化合物4a能在神經(jīng)分化早期顯著上調(diào)PGC-1α、Nrf1和TFAM mRNA水平，促進(jìn)線粒體生物合成;干擾PPAR-β蛋白表達(dá)能下調(diào)化合物4a引起的上述轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平，表明PPAR-β在化合物4a促神經(jīng)前體細(xì)胞線粒體生物合成中發(fā)揮重要作用?；衔?a能在神經(jīng)分化早期顯著上調(diào)PGC-1α蛋白，該結(jié)果與RT-PCR結(jié)果相符;同時(shí)，化合物4a能選擇

15、性上調(diào)分裂蛋白Drp1和融合蛋白Mfn2的表達(dá)，提示化合物4a能在神經(jīng)分化早期調(diào)控線粒體分裂融合;干擾PPAR-β蛋白表達(dá)能下調(diào)化合物4a引起的PGC-1α、Drp1和Mfn2蛋白表達(dá)，表明PPAR-β在化合物4a促神經(jīng)前體細(xì)胞線粒體生物合成和分裂融合中發(fā)揮重要作用，從而滿足細(xì)胞神經(jīng)分化的能量需求，免疫熒光雙染的結(jié)果也與之相符。干擾PPAR-β蛋白表達(dá)降低了神經(jīng)分化早期細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗速率，但無(wú)顯著差異;與線粒體呼吸相關(guān)的氧氣消耗率O

16、CR值隨著PPAR-β蛋白沉默顯著下調(diào)，而與糖酵解相關(guān)的胞外酸化率ECAR值則上調(diào)，以上結(jié)果表明干擾PPAR-β蛋白表達(dá)雖然對(duì)細(xì)胞的葡萄糖消耗速率影響不大，但能抑制化合物4a引起糖酵解向線粒體呼吸的轉(zhuǎn)變作用，從而降低了葡萄糖的利用效率，影響神經(jīng)分化進(jìn)程。線粒體Ca2+特異性染料Rhod-2檢測(cè)結(jié)果表明，干擾PPAR-β蛋白表達(dá)能拮抗化合物4a調(diào)控的線粒體Ca2+瞬變功能。同時(shí)，Rhod-2和Mito green的共染結(jié)果也顯示，干擾PP

17、AR-β蛋白表達(dá)能降低神經(jīng)分化早期細(xì)胞線粒體中的Ca2+濃度，提示了干擾PPAR-β蛋白表達(dá)能影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)態(tài)維持和線粒體能量代謝。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明化合物4a能促進(jìn)活性形式GSK3β向非活性形式p-GSK3β的轉(zhuǎn)變，從而減少了β-catenin由于被GSK3β磷酸化而發(fā)生的降解，使β-catenin的含量升高。β-catenin入核后與TCF結(jié)合，啟動(dòng)下游PPAR-β等目的基因表達(dá)，從而進(jìn)一步促進(jìn)Nestin表達(dá)上升。選

18、取β-catenin/TCF的抑制劑FH535最佳濃度15μmol/L進(jìn)行研究，結(jié)果表明FH535對(duì)β-catenin的表達(dá)量不影響，但通過(guò)抑制β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄活性，下調(diào)了PPAR-β和Nestin的表達(dá)，化合物4a可以部分逆轉(zhuǎn)FH535的拮抗作用。以上結(jié)果表明β-catenin/TCF信號(hào)通路確實(shí)參與化合物4a促PPAR-β蛋白表達(dá)上調(diào)。受體配體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PPAR-β受體激動(dòng)劑L165041與PPAR-β結(jié)

19、合的IC50是39.90 nmol/L，而化合物4a是11.2μmol/L，提示化合物4a具有競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合PPAR-β的作用，但效價(jià)顯著低于L165041。分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步模擬了化合物4a與PPAR-β的具體結(jié)合情況，打分結(jié)果也輔助表明化合物4a與PPAR-β具有一定親和力，但本實(shí)驗(yàn)中化合物4a促神經(jīng)分化所選濃度為10-7 mol/L，在該濃度下化合物4a與PPAR-β競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合能力有限，提示化合物4a直接激活PPAR-β并不是發(fā)揮促神經(jīng)

20、分化作用的主要原因。RXR在神經(jīng)分化早期各組細(xì)胞中均表達(dá)，提示具備與PPAR-β結(jié)合形成異源二聚體的物質(zhì)基礎(chǔ)，但是不論加入化合物4a處理或是干擾PPAR-β蛋白表達(dá)都不影響RXR的表達(dá)水平，提示RXR的蛋白表達(dá)水平與化合物4a促PPAR-β轉(zhuǎn)錄活性關(guān)系不大。
　　結(jié)論:
　　1.黃酮類化合物4a能提高神經(jīng)特異性蛋白表達(dá)和突觸囊泡攝取功能，具有促小鼠ES細(xì)胞定向分化為神經(jīng)元活性，MEK-ERK1/2通路參與此過(guò)程。
　　

21、2.化合物4a能通過(guò)促線粒體成熟和維持膜電位正常水平，調(diào)整線粒體分布，促神經(jīng)分化早期細(xì)胞糖酵解向氧化磷酸化轉(zhuǎn)變，來(lái)滿足細(xì)胞軸突生長(zhǎng)和神經(jīng)分化能量需求。發(fā)現(xiàn)了化合物4a能誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞中線粒體引領(lǐng)軸突生長(zhǎng)現(xiàn)象。
　　3.化合物4a主要通過(guò)β-catenin/TCF信號(hào)通路上調(diào)PPAR-β蛋白表達(dá)來(lái)提高其轉(zhuǎn)錄活性，并經(jīng)由PPAR-β-Mfn2-[Ca2+]M調(diào)控線粒體能量代謝，促使神經(jīng)分化早期細(xì)胞能量代謝方式轉(zhuǎn)變來(lái)滿足細(xì)胞神經(jīng)分化的