人類脂肪組織來源成體干細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物特征及轉(zhuǎn)基因向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:研究人類脂肪組織來源成體干細(xì)胞(hADASc)體外分離、培養(yǎng)及表面抗原分子特征；研究人類脂肪組織來源成體干細(xì)胞(hADASc)體外培養(yǎng)的生物學(xué)特征及供體年齡對其生長增殖的影響；探討將編碼TGF-β1的PGL3-TGFβ1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人類脂肪組織來源干細(xì)胞，細(xì)胞通過自分泌作用，定向誘導(dǎo)向軟骨細(xì)胞分化的可行性，為進(jìn)一步“基因加強(qiáng)組織工程學(xué)”修復(fù)軟骨損傷研究提供一定的體外實(shí)驗(yàn)依據(jù)，從實(shí)驗(yàn)室階段客觀評價(jià)其向軟骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的可行性和能

2、力，為在體研究和臨床研究、應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)室研究基礎(chǔ)。 方法： 1．不同年齡組志愿者(<20歲、21～40歲，41～60歲和>61歲，共4個(gè)年齡組)，手術(shù)切除少量皮下脂肪組織，0．075﹪I型膠原酶37℃酶消化，100run濾網(wǎng)過濾、洗滌，接種在25cm<'2>培養(yǎng)瓶中，24小時(shí)后觀察，予換液棄去原始培養(yǎng)基和漂浮細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)，3天換液一次，細(xì)胞融合率達(dá)到約80﹪時(shí)，1:250胰蛋白酶消化，按照1:2～3比例傳代培養(yǎng)，傳至2

3、0代； 2.取培養(yǎng)第3代細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原標(biāo)記物(CD29，CD34，CD44，CD45，CD49d，HLA-DR，CD106)和細(xì)胞周期； 3．細(xì)胞培養(yǎng)傳20代后進(jìn)行細(xì)胞染色體組分析； 4．MTT。法分別檢測各年齡組不同時(shí)間點(diǎn)吸光值，繪制生長曲線，計(jì)算人類脂肪來源干細(xì)胞倍增時(shí)間(Time Doubling，TD)； 5.鑒定PGL3-TGFβ1重組質(zhì)粒，Kpn I和Nhe I內(nèi)切酶雙酶切消

4、化，水平分離電泳，DNA測序，Blast軟件在GenBank上進(jìn)行序列比對鑒定； 6．運(yùn)用脂質(zhì)體(FuGENE 6)轉(zhuǎn)染方法，將PGL3-TGFβ1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人類脂肪組織來源干細(xì)胞，繪制轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生長曲線，檢測Luceferase活性，MTT法(490nm波長)檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的吸光值，評價(jià)轉(zhuǎn)染對細(xì)胞生長活力的影響； 7.轉(zhuǎn)染后人類脂肪組織來源干細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞的TGF-β1基因RT-PCR檢測，以培養(yǎng)的P3代

5、未轉(zhuǎn)染外源基因的人類脂肪來源干細(xì)胞以常規(guī)體外培養(yǎng)為對照組； 8.制備細(xì)胞爬片，在培養(yǎng)的第9天，進(jìn)行抗II型膠原的免疫組織化學(xué)染色(SABC法)分析。 結(jié)論： 1、結(jié)合酶消化法和貼壁篩選法，自少量人類皮下脂肪組織可體外分離培養(yǎng)出具有干細(xì)胞特征的有核組織細(xì)胞，連續(xù)傳代20代以上遺傳特性穩(wěn)定； 2、供體年齡對人類脂肪組織來源干細(xì)胞體外培養(yǎng)生長活力具有一定的影響作用，青年來源細(xì)胞生長活力強(qiáng)于老齡供體來源的細(xì)胞；

6、 3、hADASc細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志：CD 29(+)CD 44(+)；造血干細(xì)胞標(biāo)記物CD 34(-)和CD 45(-)；成纖維細(xì)胞來源標(biāo)記HLA-DR(-)；CD 106(-)，CD49d(±) 4、脂質(zhì)體法將PGL3-TGF β1重組基因轉(zhuǎn)染hADASc，細(xì)胞內(nèi)表達(dá)TGF-β1，但對細(xì)胞生長活力有一定影響，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長活性下降； 5、轉(zhuǎn)染細(xì)胞自分泌TGF-β1，連續(xù)培養(yǎng)9天，hADASc表現(xiàn)出軟骨細(xì)胞分