人表皮細胞培養(yǎng)及細胞膜片在供皮區(qū)應用的研究.pdf

1、該實驗將著眼于異體表皮細胞分離、優(yōu)化血清培養(yǎng)和傳代條件以及人纖維蛋白膠為載體的氣液界面培養(yǎng)表皮細胞膜片在供皮區(qū)臨床應用移植的相關研究.第一部分,pH值對人表皮基底層細胞分離及培養(yǎng)的影響.目的:觀察中性蛋白酶和胰蛋白酶聯(lián)合熱消化分離表皮基底層細胞過程中,pH值對表皮分離的影響.觀察不同時間點的表皮分離情況并評分記錄,得到表皮完全分離的最短時間.觀察分離細胞的培養(yǎng)生長情況.方法:分別用3種pH值水平的中性蛋白酶在37℃條件下消化分離全厚皮的

2、表皮,分離過程中對分離狀況進行觀察、評分并記錄.至其中有一組表皮完全分離的時候,將各組各觀察時間點的評分求和,并進行比較.分離的表皮和真皮做病理切片觀察基底層分離情況.分離的表皮繼續(xù)用相同的胰蛋白酶消化分離得到表皮基底層細胞.用臺盼藍染色檢測細胞活性.然后SP法染色,用K-19抗體標記分離的基底層干細胞,計數(shù)染色陽性細胞,并比較.將各組細胞按相同條件分別接種培養(yǎng),考察其生長增殖能力.第二部分,優(yōu)化表皮細胞血清培養(yǎng)和傳代條件.目的:采用D

3、F12血清培養(yǎng)基系統(tǒng),調(diào)節(jié)其中鈣離子濃度,觀察不同鈣離子濃度狀況下表皮細胞的生長情況;比較用0.25﹪中性蛋白酶和0.2﹪EDTA溶液作為消化液進行傳代與傳統(tǒng)的0.25﹪胰蛋白酶溶液傳代方法.方法:測定四種不同配比的DF12培養(yǎng)基和小牛血清的生化指標,計算出各種配制培養(yǎng)基的鈣離子濃度.調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的鈣離子濃度,鏡下觀察對比四種不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的傳代表皮細胞生長情況;將用0.25﹪中性蛋白酶和0.2﹪EDTA溶液消化傳代的細胞與0.25﹪胰蛋

4、白酶溶液傳代細胞進行培養(yǎng),計算細胞活性、貼壁率、克隆形成率;測定細胞增殖活力及制作細胞生長曲線,按XTT細胞增殖測定試劑盒操作方法,以酶聯(lián)免疫檢測儀于450nm波長測定光吸收值(OD值),根據(jù)OD值制作反映細胞增殖活力的細胞生長曲線.采用碘化丙啶一步熒光染色法流式細胞儀檢測表皮細胞的細胞周期,對比各個細胞周期階段的細胞比率,分析細胞的增殖能力.第三部分,異體表皮細胞膜片的臨床應用.目的:觀察以人纖維蛋白膠膜為載體在體外用氣液界面法培養(yǎng)的