表皮細(xì)胞培養(yǎng)中維持干細(xì)胞特性相關(guān)技術(shù)的研究.pdf

1、目的：（1）利用流式細(xì)胞儀檢測表皮細(xì)胞整合素β1亞基（CD29）和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的熒光標(biāo)記強(qiáng)度,建立簡便易行的表皮干細(xì)胞檢測方法.（2）利用該檢測手段,通過優(yōu)化表皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)條件,以提高培養(yǎng)表皮細(xì)胞中的干細(xì)胞數(shù)量.（3）構(gòu)建人整合素β1基因重組腺病毒載體,轉(zhuǎn)染表皮細(xì)胞,觀察其生物學(xué)特征的改變,為進(jìn)一步皮膚組織工程研究提供理論基礎(chǔ)和研究手段.方法：（1）分離表皮細(xì)胞,通過粘附選擇富集表皮干細(xì)胞和短暫擴(kuò)充細(xì)胞,觀察細(xì)胞克隆形

2、成率,流式細(xì)胞儀檢測表皮細(xì)胞CD29和PCNA、熒光免疫組織化學(xué)檢測BrdU的熒光標(biāo)記強(qiáng)度,分析上述指標(biāo)間的相關(guān)性.（2）利用L16（4<'4>）正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn),選擇原代培養(yǎng)消化過程中DispaseⅡ酶與胰蛋白酶不同濃度和作用時間,以及無血清培養(yǎng)基中EGF、胰島素、霍亂毒素、氫化考的松的不同濃度為實(shí)驗(yàn)因素,考察表皮細(xì)胞生物學(xué)性狀和其中CD29<'+>/PCAN<'->細(xì)胞的比例,優(yōu)化最佳分離和培養(yǎng)條件.（3）利用AdeasyTM系統(tǒng)構(gòu)建

3、含ITG-β1基因片段的重組腺病毒載體,轉(zhuǎn)染人原代培養(yǎng)表皮細(xì)胞,觀察細(xì)胞克隆形成率和CD29<'+>/PCAN<'->細(xì)胞的比例.結(jié)論：（1）CD29<'+>/PCAN<'->細(xì)胞比例與鑒定干細(xì)胞的基本指標(biāo)BrdU陽性率及細(xì)胞周期均具有良好的相關(guān)性,可以作為表皮干細(xì)胞的檢測指標(biāo).（2）對于原代表皮細(xì)胞分離培養(yǎng),0.125﹪ DispaseⅡ酶冷消化10h,0.1﹪胰蛋白酶37℃消化30min,培養(yǎng)體系中EGF、胰島素、霍亂毒素、氫化考的