豬繁殖與呼吸綜合征病毒河北地方株ORF7基因的原核表達(dá)及ELISA方法的建立.pdf

1、分類號：墨墨主!：三壘密級：壘五單位代碼：!QQ墨魚學(xué)號：2Q123塾豬繁殖與呼吸綜合征病毒河北地方株ORF7基因的原核表達(dá)及ELISA方法的建立ExDressionandDuri6cationofNgeneofPI之RSVisolateEXDreSSlOnannDUrlIlCanOn0I一2ene0IrKK3VlS0laIefromHebeiandEstablishmentofNELISA學(xué)位申請人：孫明潭指導(dǎo)教師：孫繼國教授袁萬哲副

2、教授學(xué)科專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)碩士授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期：二。一五年五月二十四日摘要豬繁殖與呼吸綜合征(Porcinereproductivea11drespirato巧syndmme，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinereproductiveand11espiratorysyndromevirus，PI汛SV)引起的一種母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道癥狀的傳染病，又稱豬藍(lán)耳病。PRRS已成為當(dāng)前困擾中國養(yǎng)豬

3、業(yè)健康發(fā)展的主要烈性傳染病之一。本課題旨在從河北省本地豬場分離毒株，通過與GenbaIll【上發(fā)表的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行對比，了解河北PRRSV的分子流行病學(xué)特點(diǎn)。以本地分離株為基礎(chǔ)，克隆表達(dá)編碼PI汛S病毒粒子中含量最多、免疫原性最強(qiáng)蛋白的OI心7基因，構(gòu)建成熟的原核表達(dá)系統(tǒng)，并將表達(dá)的N蛋白作為包被抗原建立間接ELISA方法。本研究從河北省多地送檢的疑似PI汛S陽性病料進(jìn)行RTPCR鑒定，將確診的陽性病料接種Marc一145細(xì)胞，

4、然后連續(xù)傳代。其中河北新樂市送檢病料接種Marc145細(xì)胞后經(jīng)過5代盲傳后，出現(xiàn)典型細(xì)胞病變(CPE)，初步分離到一株病毒，暫命名為PRRSVHBXL株。進(jìn)一步對其ORF5與NSP2基因克隆測序，經(jīng)同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化樹等分析，表明該毒株OI江5與NSP2基因與國內(nèi)流行的缺失變異株遺傳關(guān)系較近，與國內(nèi)外經(jīng)典美洲型毒株及基因重組毒株QYYz遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)且與歐洲型Lv毒株處于不同分支；0RF5基因編碼的200個氨基酸的第13位、151位均為

5、具有強(qiáng)毒特性的精氨酸(R)，第137位為具有野毒特性的絲氨酸(S)；與經(jīng)典美洲株相比，該毒株NSP2基因分別發(fā)生3個堿基和87個堿基的不連續(xù)缺失。說明HBXL株屬于美洲型PRRSV并存在不斷變異的趨勢。設(shè)計1對添加酶切位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增PRRSVHBxL株的0RF7全基因，并與原核表達(dá)載體pET32a連接，構(gòu)建OI江7基因的原核表達(dá)系統(tǒng)pET32aN；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL2l感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG的誘導(dǎo)表達(dá)，SDS—PAGE可檢測到分

6、子質(zhì)量約為340kDa的目的蛋白；經(jīng)w色stemblotting分析，表明該重組蛋白具有良好的免疫原性；并對表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明在誘導(dǎo)時間為4h，IPTG濃度15mM，誘導(dǎo)溫度為37℃的條件下目的蛋白表達(dá)量最大。將表達(dá)純化后的N蛋白作為包被抗原，按一定的稀釋度倍比稀釋。采集PRRSV陽性豬血清，按一定稀釋度倍比稀釋。測定各步驟反應(yīng)的條件，成功建立ELISA方法。重組抗原包被濃度為223幽111，37℃1h或者4℃過夜；封閉液為2

7、％的明膠，37℃封閉1h；血清1：80稀釋，37℃作用1h；酶標(biāo)二抗1：1000稀釋，37℃作用40min；底物(TMB)室溫顯色15min；若檢測的OD4500363則為陽性，若檢測的OD450034則為陰性。該方法與商業(yè)化的美國IDEXXPRRSV抗體檢測試劑盒的符合率為916％，其中相對敏感性為923％，相對特異性為904％，結(jié)果無顯著差異。說明本研究建立的間接ELISA方法具有良好的特異性、敏感性，有很好的臨床應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞：