豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5a蛋白結(jié)構(gòu)與功能的研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失，而目前涉及到PRRSV復(fù)制過程的分子機(jī)制仍不甚明了。其中，ORF5a蛋白是PRRSV最近鑒定出的結(jié)構(gòu)蛋白。我們在實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)擁有的PRRSV全長感染性克隆的基礎(chǔ)上，證實(shí)ORF5a基因?yàn)閮尚蚉RRSV復(fù)制所必須。接下來，對ORF5a蛋白的結(jié)構(gòu)與功能及與其它結(jié)構(gòu)蛋白相互作用關(guān)系等進(jìn)行了解析，促進(jìn)了對動(dòng)脈炎病毒及PRRSV復(fù)制過程的進(jìn)一步了解。
　　本研究具體內(nèi)容如下:

2、r>　　1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF4/ORF5區(qū)間基因插入研究
　　為解決當(dāng)前PRRSV弱毒疫苗無法區(qū)分野毒感染和疫苗接種的問題。實(shí)驗(yàn)以JXM100為骨架構(gòu)建的全長感染性克隆為基礎(chǔ)，在不影響亞基因5結(jié)構(gòu)的情況下在ORF4/ORF5區(qū)間插入3～6個(gè)堿基，構(gòu)建ORF4/ORF5區(qū)間基因插入突變克隆pAJXMin3、pAJXMin4、pAJXMin5、pAJXMin6。通過轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞進(jìn)行病毒拯救，發(fā)現(xiàn)插入3或6個(gè)堿基病毒

3、可以拯救而4或5個(gè)堿基不能被拯救。對插入突變致死的突變體分析發(fā)現(xiàn)可以檢測到亞基因組5、6、7的轉(zhuǎn)錄及GP5、N蛋白的表達(dá)，說明突變沒有影響病毒亞基因組轉(zhuǎn)錄和下游基因表達(dá)。通過對ORF4/ORF5區(qū)間序列分析發(fā)現(xiàn)其中存在潛在ORF5a，推測ORF5a蛋白為PRRSV復(fù)制過程所必須。本研究在2型PRRSVORF4/ORF5區(qū)間中，成功插入基因標(biāo)識(shí)，為創(chuàng)制新型基因工程標(biāo)記疫苗奠定了基礎(chǔ)。
　　2、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）OR

4、F5a蛋白對病毒感染性影響解析
　　最新研究表明與PRRSV同屬的馬動(dòng)脈炎病毒(EAV)ORF5a蛋白對病毒的感染性非常重要但非必需。而我們在對ORF5密碼子優(yōu)化及ORF4/ORF5基因區(qū)間插入研究過程中發(fā)現(xiàn)破環(huán)ORF5a將造成病毒拯救失敗。因此，推測ORF5a蛋白在PRRSV復(fù)制過程中是必須的。為了進(jìn)一步驗(yàn)證假設(shè)，利用1型(pSHE)和2型(pAJXM和pAPRRS)PRRSV全長感染性克隆，在不影響其它基因編碼蛋白及亞基因組二

5、級(jí)結(jié)構(gòu)的情況下敲除ORF5a基因，構(gòu)建全長感染性克隆pSHEk5a、pAJXMk5a、pAPRRSk5a。轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，結(jié)果突變病毒拯救失敗，但是突變體病毒結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)沒有受到影響。接下來，通過在ORF5a敲除突變體過程中共同轉(zhuǎn)染ORF5a真核表達(dá)載體的順式互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ORF5a敲除突變體可以利用順式表達(dá)的ORF5a蛋白，包裝出單輪感染性病毒粒子。說明突變病毒致死的原因是沒有ORF5a蛋白的表達(dá)，證實(shí)ORF5a蛋白為病毒感染性

6、必須。最后，在pAJXM全長感染性克隆中研究了不同長度ORF5a對PRRSV病毒復(fù)制的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)46個(gè)氨基酸的ORF5a生長速度明顯快于延伸后的類型，暗示ORF5a在病毒復(fù)制過程中起重要作用。
　　3、豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5a蛋白保守半胱氨酸的研究
　　通過對比目前在臨床中分離的PRRSV基因組序列中ORF5a序列，發(fā)現(xiàn)在2型PRRSV中ORF5a蛋白29和30位存在保守半胱氨酸。為研究ORF5a蛋白保守半胱氨酸

7、在病毒復(fù)制過程中的作用。我們將感染性克隆pAJXM中半胱氨酸突全部或部分突變?yōu)榻z氨酸（serine），構(gòu)建全長感染性克隆pAJXMS1、pAJXMS2、pAJXMSS。將突變體克隆轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞均拯救出了突變病毒。說明ORF5a蛋白的保守半胱氨酸對病毒復(fù)制是非必需的，但pAJXMS2和pAJXMSS第30位突變?yōu)榻z氨酸突變體病毒生長特性受到嚴(yán)重影響。接著，將pAJXM中半胱氨酸突全部或部分突變?yōu)楦拾彼?glycine)，構(gòu)建全長感

8、染性克隆pAJXMG1、pAJXMG2、pAJXMGG。pAJXMG2和pAJXMGG第30位突變?yōu)楦拾彼釙r(shí)無法拯救出病毒。隨后，采用雙分子互補(bǔ)熒光實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，ORF5a蛋白第30位突變?yōu)楦拾彼釙r(shí)影響ORF5a蛋白同源二聚體形成。體外實(shí)驗(yàn)分析ORF5a蛋白發(fā)現(xiàn)ORF5a蛋白同源二聚體通過非共價(jià)鍵形式形成。上述研究結(jié)果說明ORF5a蛋白的保守半胱氨酸對病毒復(fù)制是非必需，而ORF5a蛋白非共價(jià)鍵同源二聚體對PRRSV復(fù)制過程是必須的;OR

9、F5a蛋白的第30位半胱氨酸為該蛋白的關(guān)鍵位點(diǎn)。
　　4、豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5a蛋白與病毒其它結(jié)構(gòu)蛋白相互作用的研究
　　目前對于ORF5a蛋白與PRRSV其它結(jié)構(gòu)蛋白相互作用關(guān)系仍不清楚。為了研究ORF5a蛋白與病毒其它結(jié)構(gòu)蛋白相互作用關(guān)系，首先分析PRRSV感染MARC-145細(xì)胞過程中，ORF5a蛋白在MARC-145細(xì)胞中的定位，發(fā)現(xiàn)ORF5a蛋白主要定位于細(xì)胞的核周隙及細(xì)胞膜上，與病毒的其它結(jié)構(gòu)蛋白有著類