一個灰葡萄孢菌拮抗基因的生物信息學(xué)分析、克隆及表達.pdf

1、番茄灰霉病是一種重要的植物病害，由半知菌亞門灰葡萄孢屬(Botrytis cinerea)真菌引起。近年來人們通過大量篩選并加以改良利用抗灰霉病的生防菌，使生物防治技術(shù)日益成為控制灰霉病的一條重要而且有效的途徑。通過宏基因組技術(shù)可以大大提高生防基因的篩選范圍，進而對拮抗基因及其蛋白的拮抗機理進行深入研究。
　　本研究在劉舒等人構(gòu)建的番茄灰霉病病株根際土壤宏基因組文庫的基礎(chǔ)上，探討文庫中拮抗活性很強的9＃克隆子對Botrytis c

2、inerea的拮抗機理。本研究首先對9＃克隆子的穩(wěn)定遺傳性進行了檢測，經(jīng)過傳代培養(yǎng)10次后，9?？寺∽訉otrytis cinerea仍然具有較強的拮抗活性，說明9?？寺∽拥霓卓剐阅軌蚍€(wěn)定遺傳。通過提取9?？寺∽又亟MpBluescriptⅡ KS+質(zhì)粒DNA，經(jīng)PstI和HindⅢ雙酶切檢測和測序后，證明重組質(zhì)粒上插入了一段大小2215bp的外源DNA。
　　結(jié)合生物信息學(xué)工具和軟件，對該外源DNA序列進行分析，主要包括DNA序

3、列同源性比對，最大開放閱讀框(ORF)的查找，編碼蛋白序列的同源性及蛋白的一二三級結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明，該序列在Genebank中進行blastn比對，同源性很低，只有4％，推測可能是新拮抗基因；該序列含有一個612bp的最大ORF，編碼一個小分子量疏水性脂溶蛋白，分子量為22.2kDa，與AMP核苷酶序列的同源性較高；模體搜索表明該序列含有5個蛋白激酶C磷酸化位點、1個酪蛋白激酶II磷酸化位點和3個N-豆蔻?；稽c，推測該基因可能在拮抗

4、灰葡萄孢菌過程的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。
　　為了進一步驗證該序列表達產(chǎn)物對Botrytis cinerea的拮抗性，即該序列的最大ORF能否成功表達。以重組pBluescript II KS+質(zhì)粒DNA為模板，用引物PST-F和HIND-R進行PCR，擴增出外源DNA片段，然后以外源DNA片段為模板，在最大ORF兩端設(shè)計引物EcoRI-F和SalI-R，經(jīng)PCR擴增出最大ORF，與pET-32a(+)構(gòu)建重組表達載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)