重癥失血性休克及復蘇條件下大鼠VAP-1表達規(guī)律及調控機制研究.pdf

1、[背景]
　　 基于目前重度失血性休克救治中靶向治療手段的缺乏，以及創(chuàng)傷失血性休克相關基礎研究與臨床的脫節(jié)，急切需要我們重新審視已知對創(chuàng)傷失血性休克病理的認識。前期，我們在一種相對接近臨床的肝左外葉切除+2.5ml/100g(體重)的大鼠創(chuàng)傷失血性休克模型上，摸索到24小時死亡率接近50％的干預條件，之后對存活和死亡大鼠失血前肝臟進行表達譜基因研究，篩查出約100個差異基因，隨后對這些差異基因進行調控網絡分析。數據表明有18個基

2、因參與了這些差異基因的網絡調控，結合專業(yè)知識，AOC3基因由于其編碼蛋白具有細胞粘附功能及SSAO活性而進入我們視野。
　　 AOC3基因所編碼的蛋白是一個由763個氨基酸組成的含銅胺氧化酶(CAOs)，稱為VAP-1。VAP-1是一種具有雙重功能的蛋白。一方面作為內皮細胞粘附因子(VAP-1)可誘導白細胞粘附至血管內皮；另一方面作為胺氧化酶(SSAO)可催化芳香族和脂肪族的伯胺類物質轉化成相應的醛類，并產生H2O2和NH3。通

3、過文獻復習我們發(fā)現VAP-1蛋白的功能與重癥休克期微循環(huán)障礙及血管反應性降低有密切聯系。因此我們認為VAP-1在重癥休克病理過程中可能具有重要意義，有必要進行研究闡明，以期為臨床救治重癥休克提供一種新的治療手段。
　　 [目的]
　　 1、明確大鼠定壓失血性休克-復蘇過程中肝臟組織AOC3基因及其編碼蛋白VAP-1表達的變化規(guī)律；
　　 2、明確大鼠定壓失血性休克-復蘇過程中血液中sVAP-1含量及SSAO酶活性

4、的變化規(guī)律；
　　 3、構建AOC3過表達腺病毒載體，為下一步體外功能實驗奠定基礎；
　　 4、檢測AOC3過表達重組腺病毒對大鼠肝血竇內皮細胞的轉染作用；
　　 5、明確低氧環(huán)境中大鼠肝血竇內皮細胞AOC3基因及其編碼蛋白VAP-1的表達規(guī)律。
　　 [方法]
　　 1、大鼠定壓失血性休克模型的建立；
　　 2、通過大鼠定壓失血性休克模型在休克-復蘇過程中的既定時間點采集大鼠肝臟組織標本

5、，通過Real-timePCR、Western-Blot及免疫組化等方法檢測休克-復蘇各階段AOC3基因及其編碼蛋白VAP-1的表達情況；
　　 3、通過大鼠定壓失血性休克模型采集大鼠休克-復蘇既定時間點的外周血，使用ELISA法及分光光度計分別檢測休克-復蘇過程不同階段sVAP-1含量及SSAO酶活性；
　　 4、AOC3過表達腺病毒載體的設計、構建、病毒包裝、大量擴增、濃縮及滴定測定，用腺病毒轉染大鼠腸微血管內皮細胞

6、并測定MOI值；
　　 5、用重組腺病毒及空病毒轉染大鼠肝血竇內皮細胞，并通過降低細胞培養(yǎng)箱氧濃度制造低氧環(huán)境。使用Real-timePCR、Western-Blot檢測大鼠肝血竇內皮細胞在腺病毒轉染前后在常氧條件及低氧條件下其AOC3基因及編碼蛋白VAP-1的表達情況。
　　 [結果]
　　 1、建立了穩(wěn)定的大鼠定壓失血性休克模型；
　　 2、在定壓失血性休克-復蘇過程中，Real-timePCR結果顯

7、示肝臟組織AOC3基因表達量休克組顯著高于復蘇組及對照組，復蘇組顯著高于對照組；
　　 3、在定壓失血性休克-復蘇過程中，Western-blot結果顯示在肝臟組織VAP-1/GAPDH蛋白濃度比值休克組顯著高于復蘇組及對照組，復蘇組明顯高于對照組；
　　 4、大鼠定壓失血性休克-復蘇過程中，ELISA定量結果顯示血清中sVAP-1含量休克組顯著高于復蘇組及對照組，復蘇組顯著高于對照組。SSAO酶活性測定結果顯示血清中酶

8、活性休克組顯著高于復蘇組及對照組，復蘇組顯著高于對照組；
　　 5、成功建立AOC3過表達腺病毒載體(pIRES-EGFP-AOC3)，重組腺病毒感染大鼠腸微血管內皮細胞的MOI值選取5-10為最佳；
　　 6、在常氧及低氧培養(yǎng)條件下，Real-timePCR結果均顯示大鼠肝血竇內皮細胞經重組腺病毒轉染后其AOC3表達量顯著高于轉染前，而該細胞經空病毒轉染前后的AOC3表達量無顯著差異。Western-blot結果顯示相

9、同的趨勢；
　　 7、Real-timePCR結果顯示無論大鼠肝血竇內皮細胞是否經重組腺病毒或空病毒轉染，在低氧培養(yǎng)條件下其AOC3表達量均顯著高于常氧培養(yǎng)條件。Western-blot結果雖然顯示相同的趨勢，但差異并不如Real-timePCR結果顯著。
　　 [結論]
　　 1、體內試驗證實大鼠重癥休克病程中肝臟組織及血清中VAP-1的含量升高，血清中SSAO酶活性增強，而隨著復蘇的進行，各組織中VAP-1含