人重組SPINK6蛋白的純化工藝與活性測(cè)定.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?人絲氨酸蛋白酶抑制物KazalⅥ型（SPINK6）是一種功能廣泛的蛋白酶抑制劑，本實(shí)驗(yàn)室在細(xì)小病毒H1的研究中首次發(fā)現(xiàn)了其抗腫瘤活性。為進(jìn)一步開展蛋白水平的研究工作，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了畢赤酵母外分泌表達(dá)系統(tǒng)，通過(guò)親和純化的方法獲得了純度大于95％的人重組SPINK6蛋白。同時(shí)，根據(jù)SPINK6蛋白對(duì)激肽釋放酶14（KLK14）的抑制作用建立其體外活性測(cè)定方法。
　　實(shí)驗(yàn)方法:根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛(ài)性合成一段編碼rhSPINK6

2、蛋白的基因序列，克隆到表達(dá)載體pPIC9K中，構(gòu)建出表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-rhSPINK6，轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115中進(jìn)行表達(dá)。發(fā)酵上清液經(jīng)陽(yáng)離子交換樹脂Capto MMC初純后，再以偶聯(lián)牛胰蛋白酶的Sepharose4B親和填料進(jìn)行精純。根據(jù)SPINK6蛋白抑制KLK14活性的特點(diǎn)，建立rhSPINK6的體外活性測(cè)定方法。在此基礎(chǔ)上，我們將高表達(dá)rhSPINK6的菌株接種至75L發(fā)酵罐進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，并通過(guò)離子交換結(jié)合凝膠排阻層析的方

3、法進(jìn)行產(chǎn)品純化，以獲得大量SPINK6蛋白進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:rhSPINK6在畢赤酵母中以外分泌形式表達(dá)，表達(dá)條件優(yōu)化后，表達(dá)量可達(dá)12.5 mg/L。經(jīng)Capto MMC初純和trypsin-Sepharose4B親和純化后，rhPINK6的純度大于95％，總活性回收率可達(dá)43.7％，并可高效抑制KLK14活性(Ki=0.16nM)。在此基礎(chǔ)上，我們對(duì)rhSPINK6的中試化生產(chǎn)條件進(jìn)行了摸索，最終，將rhSPINK