高效液相色譜-熒光法同時測定慢性腎功能不全患者血清中芳香族氨基酸.pdf

1、目的：
　　 1.建立一種高效液相色譜-熒光法(HPLC-FLD)同時測定健康成人血清中芳香族氨基酸(AAA)即苯丙氨酸(PHE)、酪氨酸(TYR)和色氨酸(TRP)含量。
　　 2.初步探討慢性腎功能不全(CRI)患者血清中AAA含量測定的臨床意義。
　　 方法：
　　 1.血清標(biāo)本去蛋白后，離心取20μL上清液直接進樣測定，采用Megres C18色譜柱(4.6mm×250mm i.d.，5μm)分離

2、，流動相為乙腈：水(10:90，V/V)，流速為1.0 ml/min，通過對TYR、PHE和TRP激發(fā)光波譜(范圍200～450nm)和發(fā)射光波譜(250～500nm)掃描，得到各自的最適激發(fā)光波長和最適發(fā)射光波長；TYR、PHE和TRP峰采用峰保留值和峰疊加法定性分析；用外標(biāo)法測定峰面積進行定量分析。同時探討了檢測波長、流速、PH值和流動相中有機相的比例等因素對分離度和靈敏度的影響，考察了其它物質(zhì)是否對待測組分的檢測存在干擾，并且通過

3、對線性范圍、檢測限、精密度、回收率和干擾試驗的考察，對該方法進行方法學(xué)評價。
　　 2.測定健康成人(n=100例)血清PHE、TYR和TRP含量，并計算AAA總量及TYR/PHE比值。
　　 3.測定CRI患者(n=80例)血清PHE、TYR和TRP含量，計算AAA總量及TYR/PHE比值，并用ROC曲線評價其診斷CRI的敏感度、特異度和方法學(xué)效能；CRI患者血清AAA總量、PHE、TYR及TRP含量與血清中其他相關(guān)生

4、化指標(biāo)進行簡單線性相關(guān)性分析；并探討AAA總量、PHE、TYR和TRP含量及TYR/PHE比值變化在CRI分期分型、病理生理、治療監(jiān)測等方面的臨床意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.標(biāo)準(zhǔn)品和血清樣本的TYR、PHE和TRP峰三者分離良好(分離度(R)>1.5)，TYR保留時間約為4.3min，線性方程為Y=12443.8+58345X，R=0.998，線性范圍為0.55～275.00μmol/L，最低檢測限為0.014μmo

5、l/L，回收率為98.0％～103.0％，日內(nèi)和日間RSD分別為3.92％和4.20％；PHE保留時間約為5.8min，Y=6578.32X+202946.74，R=0.997，線性范圍為3.05～1220.0μ mol/L，最低檢測限為0.51μmol/L，回收率為97.8％～104.2％，日內(nèi)和日間RSD分別為3.14％和3.37％；TRP保留時間為9.5min，Y=260440.86X-11828.17，R=0.999，線性范圍為

6、0.049～49μmol/L，最低檢測限為0.0049μmol/L，回收率為97.3％～103.5％，日內(nèi)和日間RSD分別為2.32％和3.18％；5-羥色胺、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸等物質(zhì)對本方法無干擾；三者的峰面積與進樣濃度線性關(guān)系良好。
　　 2.100例健康成人血清PHE的濃度平均為(66.72±11.57)μmol/L；TYR濃度平均為(63.53±4.68)μmol/L；TRP濃度平均為(44.22±3.67)μmol/

7、L；AAA總濃度平均為(174.47±11.57)μmol/L；TYR/PHE比值平均為(0.95±0.40)。
　　 3.80例CRI患者PHE的濃度平均為(61.98±12.38)μmol/L；TYR濃度平均為(52.27±8.25)μmol/L；TRP濃度平均為(21.49±4.25)μmol/L，AAA總濃度平均為(135.74±12.23)μmol/L；TYR/PHE比值平均為(0.84±0.67)。與正常對照組比較，

8、CRI患者組血清AAA總量、TYR、TRP含量及TYR/PHE比值均顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(AAA、TYR和TRP的t值分別為5.095、3.423和-15.774，TYR/PHE的U值為247.000，P值均<0.05)，PHE含量輕微下降，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.17，P>0.05)。CRI患者不同分期TYR、PHE和TRP含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)；慢性腎炎型、糖尿病型和高血壓型三種類型CRI患者的TY

9、R、PHE和TRP含量比較，其中TYR在慢性腎炎組、高血壓組和糖尿病組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；PHE在慢性腎炎組與糖尿病組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(U=408.00，P=0.030)；TRP在慢性腎炎組與糖尿病組、慢性腎炎組與高血壓組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(分別U=327.00，P=0.002；U=99.00，P=0.033)。CRI患者血清PHE與UREA、UA有一定相關(guān)性(P<0.05)；TRP與UA、AAA與UA、TP與TRP

10、分別具有一定的相關(guān)性(P均<0.05)。血清AAA總量診斷CRI的ROC曲線的AUC為0.962，當(dāng)以<157.43μmol/L為臨界值時，其敏感度和特異度分別為88.9％和100.0％。
　　 結(jié)論：
　　 1.本文建立了一種能夠同時測定PHE、TYR和TRP的HPLC-FLD法，并運用該方法測定100例健康成人血清PHE、TYR和TRP含量，方法簡便、快速、靈敏，適于臨床和科研應(yīng)用。
　　 2.初步探討了血清