蕃茄黃化曲葉病毒和黃瓜綠斑駁花葉病毒單克隆抗體的制備及其檢測(cè)應(yīng)用.pdf

1、以抗體為核心建立的血清學(xué)方法用于植物病毒的檢測(cè)具有操作方便、快捷、靈敏以及高通量等優(yōu)點(diǎn),但國(guó)內(nèi)制備的植物病毒抗體并不多,大多數(shù)重要植物病毒的檢測(cè)得依賴進(jìn)口的抗體或者試劑盒。因此,制備重要植物病毒的特異性抗體、建立相應(yīng)的血清學(xué)檢測(cè)方法對(duì)植物病毒的檢測(cè)及口岸檢驗(yàn)檢疫和防治具有重要意義。番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellow leaf curl virus,TYLCV)是嚴(yán)重危害番茄生產(chǎn)的雙生病毒之一,而黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbe

2、r green mottle mosaicvirus,CGMMV)是我國(guó)近年來葫蘆科作物上發(fā)生的又一重要的檢疫性病毒。本論文分別制備了抗TYLCV和CGMMV的特異性單克隆抗體(Monoclonalantibodies,MAbs),并建立了相應(yīng)的的血清學(xué)檢測(cè)方法。
　　 (1)抗TYLCV單克隆抗體制備及其檢測(cè)應(yīng)用:用PCR方法從感染TYLCV上海分離物(TYLCV-SH2)的番茄基因組中克隆了該病毒的外殼蛋白(Coatprot

3、ein,CP)基因,將其插入到原核表達(dá)載體pET-32a中構(gòu)建成重組原核表達(dá)載體。重組表達(dá)載體pET-32a-CP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo),Ni+-NTA親和柱純化獲得分子量約為48 kDa的融合蛋白。以純化的重組蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠,獲得3株能穩(wěn)定傳代并分泌抗TYLCV的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞。單克隆抗體的特異性檢測(cè)表明3株單抗中3E10能與4種侵染番茄的雙生病毒反應(yīng),而另外2株(282和2E3)能特異性

4、識(shí)別TYLCV-SH2。利用單抗3E10建立了三抗夾心ELISA檢測(cè)TYLCV的方法,該方法檢測(cè)病葉的靈敏度可達(dá)1:2560(w/v,g/mL),對(duì)田間樣品的檢測(cè)表明,TYLCV在田間番茄植物上發(fā)病普遍。
　　 (2)抗CGMMV單抗制備及其檢測(cè)應(yīng)用:用提純的CGMMV病毒粒子免疫的BALB/c鼠脾細(xì)胞與SP2/0鼠骨髓瘤細(xì)胞融合,經(jīng)細(xì)胞篩選與克隆,獲得6株能穩(wěn)定傳代并分泌抗CGMMV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞,并分別制備其單抗腹水

5、。其中單抗5D11可以與CGMMV、煙草花葉病毒(TMV)和番茄花葉病毒(ToMV)3種煙草花葉病毒屬的病毒反應(yīng),單抗8E3和11812除與CGMMV有強(qiáng)陽性反應(yīng)外,與TMV和ToMV存在較弱的反應(yīng),而單抗4H1、5810和11A4僅與CGMMV有特異性反應(yīng)。利用最靈敏的4H1單抗為核心建立了檢測(cè)CGMMV的抗原包被間接ELISA方法(Antigen-coated plate enzyme-linked immunosorbentass

6、ay,ACP-EIASA)、免疫斑點(diǎn)法(Dot-blot ELISA)、組織印跡法(Tissue-blotELISA)和免疫捕獲RT-PCR(Immunocapture reverse transcriptase polymerase chainreaction,IC-RT-PCR)。建立的ACP-ELISA和Dot-blot ELISA方法檢測(cè)感染CGMMV的黃瓜植株組織的靈敏度分別高達(dá)1:40960和1:20480(w/v,g/mL