釀酒酵母表達(dá)免疫活性小肽及其在魚類養(yǎng)殖中的效應(yīng)研究.pdf

1、免疫活性肽(Immunopeptide)不僅在體外培養(yǎng)情況下刺激機(jī)體淋巴細(xì)胞的增殖、增強(qiáng)巨嗜細(xì)胞的吞噬能力，還能在生物體內(nèi)起重要的免疫調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，提高對(duì)外界病原物質(zhì)感染的抵抗能力。本論文根據(jù)糜蛋白酶專一酶切位點(diǎn)，對(duì)Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tvr、Gly-Leu-Phe等8個(gè)免疫活性小肽進(jìn)行拼接，設(shè)計(jì)出具有刺激免疫活性的雜合肽；并分別在其C-末端和N-末端添加起始密碼子ATG和釀酒酵母強(qiáng)終止密碼子TAA，以

2、保證小肽蛋白的正確表達(dá)。為便于免疫活性肽表達(dá)后的分離和檢測(cè)，在小肽序列的N-末端添加了6個(gè)His的標(biāo)簽。然后，根據(jù)釀酒酵母(S．cerevisiae)偏愛密碼子，設(shè)計(jì)出對(duì)應(yīng)的DNA序列。設(shè)計(jì)得到的DNA序列含有表達(dá)為蛋白質(zhì)所需的所有要素，命名為免疫活性小肽基因IMP。 IMP基因分兩部分進(jìn)行DNA序列合成，并通過PCR擴(kuò)增、EcoR I酶切和連接，獲得了IMP基因全序列。通過BglⅡ酶切位點(diǎn)將IMP基因克隆至穿梭質(zhì)粒載體pMA9

3、1，獲得重組載體pMA91-IMP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)PCR檢測(cè)、酶切鑒定及測(cè)序，確認(rèn)所得到的IMP基因與我們?cè)O(shè)計(jì)的基因序列完全一致，且基因插入載體的方向正確。 將重組表達(dá)載體pMA91-IMP經(jīng)LiAc/ssDNA/PEG法轉(zhuǎn)化入釀酒酵母宿主菌H158中。通過亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型YNB培養(yǎng)基篩選出轉(zhuǎn)化子，并通過菌落PCR進(jìn)行進(jìn)一步的篩選和鑒定。根據(jù)設(shè)計(jì)在小肽序列N-末端的His-tag，應(yīng)用Ni-NTA His.Bind樹

4、脂對(duì)表達(dá)的免疫活性肽進(jìn)行富集，進(jìn)而進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。結(jié)果表明免疫小肽基因IMP在酵母中得到表達(dá)。 采用不同的培養(yǎng)時(shí)間、初始pH值、葡萄糖濃度、溫度，通過搖瓶培養(yǎng)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因酵母表達(dá)條件優(yōu)化。在搖瓶?jī)?yōu)化發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，用10 L發(fā)酵罐進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。轉(zhuǎn)基因酵母發(fā)酵后經(jīng)離心濃縮，分兩個(gè)階段投喂大菱鲆(Scophthatmus maximus L.)幼苗，檢測(cè)免疫活性肽對(duì)魚苗抗病力、成活率和生長(zhǎng)的影響情況。 第一階段

5、為魚苗孵出后6到20天左右，這一階段是喂養(yǎng)管理的關(guān)鍵時(shí)期，仔魚由內(nèi)源性營(yíng)養(yǎng)向外源性營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化，死亡率較高，也是大菱鲆苗種培育過程中損失最嚴(yán)重的一個(gè)時(shí)期；先用轉(zhuǎn)基因酵母H158(pMA91-IMP)強(qiáng)化投喂輪蟲，再用強(qiáng)化后的輪蟲投喂魚苗。第二階段為魚苗孵出20天，可攝食顆粒飼料后，把轉(zhuǎn)基因酵母H158(pMA91-IMP)直接作為飼料添加劑進(jìn)行投喂。 經(jīng)過兩個(gè)多月的分組投喂實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組魚苗的成活率與體長(zhǎng)比對(duì)照組明顯增加，其中“實(shí)