牛肉風(fēng)味強(qiáng)化肽在釀酒酵母中的克隆和表達(dá).pdf

1、牛肉風(fēng)味強(qiáng)化肽（BeefyMeatyPeptide，BMP）最初是從牛肉的木瓜蛋白酶水解物中分離得到的一種八肽。經(jīng)研究分析證明，BMP與食鹽、味精有較好的協(xié)同呈味作用，能增強(qiáng)牛肉風(fēng)味，并且具有良好的熱穩(wěn)定性，可以滿足食品工業(yè)生產(chǎn)的熱處理要求。因此BMP有潛力成為新一代風(fēng)味強(qiáng)化劑。本課題在實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的BMP組成型表達(dá)載體pGAP9-16BMP，并在畢赤酵母PichiapastorisGS115(pGAP9-16BMP)中成功表達(dá)BMP基

2、礎(chǔ)上，采用基因工程方法在釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）中組成型表達(dá)BMP，利用釀酒酵母代替畢赤酵母作為宿主菌，以食品級(jí)菌株作為宿主菌，保證了表達(dá)產(chǎn)物的安全性。
　　以工程菌PichiapastorisGS115（pGAP9-16BMP）基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增PGAP-16BMP，以Scerevisiae基因組為模板PCR擴(kuò)增終止子CYC1，并將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物克隆于YEp352質(zhì)粒上，構(gòu)建成組成型表

3、達(dá)載體YEp352-16BMP。將質(zhì)粒YEp352-16BMP經(jīng)醋酸鋰法轉(zhuǎn)化到S.cerevisiaeW303-1A中，最終通過(guò)尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型平板篩選和進(jìn)一步的PCR驗(yàn)證，得到能夠分泌表達(dá)16BMP的釀酒酵母工程菌W303-1A(YEp352-16BMP)。
　　優(yōu)化工程菌W303-1A(YEp352-16BMP)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，找出影響作用較大的三個(gè)因素為葡萄糖、YP濃度和培養(yǎng)基初始pH值。通過(guò)正交試驗(yàn)選擇出

4、了最佳的搖瓶發(fā)酵條件水平組合:即葡萄糖濃度為3％(w/v)，YP濃度為1.5×，初始pH為5.0。經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，30℃發(fā)酵48h時(shí)，BMP在搖瓶水平獲得最高表達(dá)量可達(dá)190mg/L。
　　在5L發(fā)酵罐中進(jìn)行了分批發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵優(yōu)化釀酒酵母工程菌W303-1A(YEp352-16BMP)組成型表達(dá)BMP。分批發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵液中BMP在36h時(shí)獲得最大表達(dá)量為180mg/L。補(bǔ)料分批發(fā)酵時(shí)，采用分別在發(fā)酵至12h、15h、18h、21