RORα和RORγt在慢性乙型肝炎、慢加急性重型乙肝和原發(fā)性肝癌的表達(dá)和意義.pdf

1、第一部分：RORα和RORγt在慢性乙型肝炎患者中的表達(dá)及意義
　　 慢性乙型肝炎發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，宿主免疫調(diào)節(jié)紊亂是導(dǎo)致不能有效清除病毒、病情遷延不愈的重要原因。許多研究表明Th1、Th2細(xì)胞亞群的比例失衡、功能失調(diào)是導(dǎo)致慢性乙型肝炎發(fā)病的重要因素。
　　 Th17細(xì)胞是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新的效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞亞群，以產(chǎn)生白介素17(IL-17)為特征。Th17細(xì)胞的分化需要IL-6存在條件下轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)

2、的活化。維甲酸相關(guān)孤核受體γt（RORγt）作為維甲酸相關(guān)孤核受體亞家族的成員之一，屬于類固醇受體超家族。大量研究表明RORγt和RORα是調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞分化的重要因子，尤其RORγt發(fā)揮主要作用。
　　 大量證據(jù)表明Th17細(xì)胞亞群比例增加在慢性乙型肝炎的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用，調(diào)節(jié)慢性乙型肝炎患者中Th17細(xì)胞的異常可能成為慢性乙型肝炎治療的新策略。但是，對(duì)于RORγt和RORα在慢性乙型肝炎的發(fā)病中如何發(fā)揮作用尚很少

3、有研究。
　　 目的：
　　 本研究的目的是通過(guò)對(duì)慢性乙型肝炎患者外周血RORγt和RORα基因表達(dá)，Th17細(xì)胞亞群及血清細(xì)胞因子的檢測(cè)，進(jìn)一步探討RORγt和RORα在慢性乙型肝炎發(fā)病機(jī)制中的作用及評(píng)價(jià)它們的臨床相關(guān)性。
　　 方法：
　　 應(yīng)用三色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)慢性乙型肝炎患者和正常對(duì)照外周血中Th17細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的比例。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)RORt和RORα在慢性

4、乙型肝炎患者和正常對(duì)照外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中的表達(dá)。應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測(cè)慢性乙型肝炎患者和正常對(duì)照血清中IL-6，TGF-β，IL-17，IL-23和IFN-γ的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1、慢性乙型肝炎患者Th17細(xì)胞亞群的比例（1.77±0.52％）較正常對(duì)照組（0.33±0.15％）顯著升高(P＜0.05)。
　　 2、慢性乙型肝炎患者外周血RORα的mRNA水平(6.442×10-2±3.

5、17×10-2)明顯高于正常對(duì)照組（1.666×10-3±8.77×10-4，P＜0.05），慢性乙型肝炎患者外周血RORγt的mRNA水平(1.217×10-3±0.787×10-3)明顯高于正常對(duì)照組(3.207×10-4±1.38×10-4,P＜0.05)。
　　 3、慢性乙型肝炎患者血清IL-6水平（13.36±3.79pg/ml）較正常對(duì)照組明顯升高（3.43±0.55pg/ml，P＜0.01）;血清TGF-β水平（3

6、5.22±2.4ng/ml）較正常對(duì)照組明顯升高（18.28±1.8ng/ml，P＜0.01）;慢性乙型肝炎患者血清IFN-γ水平（10.17±3.38pg/ml）較正常對(duì)照組明顯降低（17.14±2.28pg/ml，P＜0.05）;慢性乙型肝炎患者血清IL-17和IL-23水平（65.38±11.65pg/ml，51.10±6.69pg/ml）較正常對(duì)照組（61.07±8.84pg/ml，45.87±4.47pg/ml）無(wú)明顯差異(P

7、≥0.05)。
　　 4、在慢性乙型肝炎患者中，RORγt、IL-6、IL-23與Th17細(xì)胞亞群比例存在明顯的正相關(guān)性(r=0.563，P=0.01;r=0.403，P=0.027;r=0.447，P=0.013)，但RORα、TGF-β、IFN-γ與Th17細(xì)胞亞群比例無(wú)相關(guān)性。
　　 5、慢性乙型肝炎患者外周血中Th17細(xì)胞亞群比例與ALT呈明顯正相關(guān)(r=0.587，P=0.005)，RORγt與ALT呈明顯正相

8、關(guān)（r=0.384，P=0.036），但RORα與ALT無(wú)相關(guān)性(r=0.064，P=0.738);ROR、RORα和Th17細(xì)胞亞群比例與外周血HBV-DNA均無(wú)相關(guān)性(r=0.031，P=0.871;r=0.315，P=0.090;r=0.222，P=0.239)。
　　 結(jié)論：
　　 我們的研究結(jié)果進(jìn)一步表明，在慢性乙型肝炎發(fā)生和發(fā)展中，Th17細(xì)胞亞群比例增加具有重要的作用;研究首次表明，作為Th17細(xì)胞分化的重

9、要調(diào)節(jié)因子，RORγt在慢性乙型肝炎的發(fā)病中可能具有重要作用。
　　 第二部分：RORα和RORγt在慢加急性重型乙型病毒性肝炎患者中的表達(dá)及意義
　　 HBV感染可引起人類急慢性肝炎，與肝硬化和肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，其中每年約有1％的乙型肝炎患者發(fā)展為重型肝炎。重型肝炎可分為急性重型肝炎(acute severe type hepatitis，ASH)、亞急性重型肝炎(subacute severe type

10、hepatitis，SSH)、慢性重型肝炎(chronic severe type hepatitis，CSH)。其中慢性重型肝炎又可分為慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)和慢性肝衰竭(chronic liver failure，CLF)。慢加急性肝衰竭是在慢性肝病基礎(chǔ)上出現(xiàn)的急性肝臟功能失代償。
　　 在我國(guó)，慢性乙型病毒性肝炎是引起慢加急性肝衰竭的主要病因，由慢性乙型病毒

11、性肝炎所致的慢加急性肝衰竭又稱為慢加急性重型乙型病毒性肝炎(ACHBLF)。ACHBLF進(jìn)展迅速，病情兇險(xiǎn)，臨床上缺乏特異、有效的治療手段，絕大部分患者預(yù)后較差。ACHBLF的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。
　　 在我們的第一部分實(shí)驗(yàn)中，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在慢性乙型肝炎異常免疫反應(yīng)中，Th17細(xì)胞亞群比例增加具有重要的作用;研究首次表明，作為Th17細(xì)胞分化的重要調(diào)節(jié)因子，RORγt在慢性乙型肝炎的發(fā)病中可能具有重要作用。
　　 目的

12、：
　　 本研究的目的是通過(guò)對(duì)慢加急性重型乙型病毒性肝炎患者外周血RORγt和RORα基因表達(dá)，Th17細(xì)胞亞群及血清細(xì)胞因子的檢測(cè)，進(jìn)一步探討RORγt和RORα在慢加急性重型乙型病毒性肝炎患者發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 方法：
　　 應(yīng)用三色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)慢加急性重型乙型病毒性肝炎患者和正常對(duì)照外周血中Th17細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的比例。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)RORγt和RORα在慢加急

13、性重型乙型病毒性肝炎患者和正常對(duì)照外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中的表達(dá)。應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測(cè)慢加急性重型乙型病毒性肝炎患者和正常對(duì)照血清中IL-6，TGF-β，IL-17，IL-23和IFN-γ的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1、慢加急性重型乙型病毒性肝炎患者外周血Th17細(xì)胞亞群比例(3.87±0.97％)明顯高于慢性乙型肝炎患者(1.77±0.52％，P＜0.01)和正常對(duì)照組(0.33±0.15％，P＜0.01

14、)。
　　 2、慢加急性重型乙型病毒性肝炎患者外周血RORα的mRNA水平(2.38×10-1±1.04×10-1)明顯高于慢性乙型肝炎患者（6.442×10-2±3.17×10-2，P＜0.05）和正常對(duì)照組（1.666×10-3±8.77×10-4，P＜0.05），慢加急性重型乙型病毒性肝炎患者外周血RORγt的mRNA水平（2.904×10-2±1.01×10-2）明顯高于慢性乙型肝炎患者(1.217×10-3±0.787

15、×10-3，P＜0.05)和正常對(duì)照組（3.207×10-4±1.38×10-4，P＜0.01）。
　　 3、慢加急性重型乙型病毒性肝炎患者血清IL-6水平（44.56±16.55pg/ml）較慢性乙型肝炎患者（13.36±3.79pg/ml）和正常對(duì)照組明顯升高(3.43±0.55pg/ml，P＜0.01);血清TGF-β水平（55.78±1.6ng/ml）較慢性乙型肝炎患者（35.22±2.4ng/ml，P＜0.05）和正常

16、對(duì)照組明顯升高（18.28±1.8ng/ml，P＜0.01）;血清IFN.γ水平(13.61±5.6pg/ml)較慢性乙型肝炎患者（10.17±3.38pg/ml）明顯升高(P＜0.05)，但較正常對(duì)照組明顯降低（17.14±2.28pg/ml，P＜0.05）;血清IL-17和IL-23水平(77.24±9.69pg/ml，55.96±25.45pg/ml)較慢性乙型肝炎患者（65.38±11.65pg/ml，51.10±6.69pg/

17、ml）和正常對(duì)照組（61.07±8.84pg/ml，45.87±4.47pg/ml）無(wú)明顯差異(P≥0.05)。
　　 4、在慢加急性重型乙型病毒性肝炎患者中，RORγt、IL-6、IL-23與Th17細(xì)胞亞群比例存在明顯的正相關(guān)性(r=0.321，P=0.044;r=0.360，P=0.027;r=0.383，P=0.015)，但RORα、TGF-β、IFN-γ與Th17細(xì)胞亞群比例無(wú)相關(guān)性。
　　 5、慢加急性重型乙

18、型病毒性肝炎患者RORγt與PTA，TBIL和MELD存在明顯的正相關(guān)性(r=-0.393，P=0.012;r=0.391，P=0.013;r=0.359，P=0.023);但是RORγt與ALT和HBV-DNA無(wú)相關(guān)性(r=-0.122，P=0.458;r=-0.303，P=0.057)。RORα與上述各指標(biāo)均無(wú)相關(guān)性。
　　 6、根據(jù)患者的結(jié)局，將慢加急性重型乙型病毒性肝炎患者分為生存組和死亡組，發(fā)現(xiàn)死亡組患者RORγt和R

19、ORα水平(4.48×10-2±1.3×10-2，4.78×10-1±9.19×10-2)高于生存組(3.34×10-2±1.5×10-2，3.55×10-1±7.65×10-2)，但無(wú)明顯差異(P＞0.05)。同樣，外周血Th17細(xì)胞亞群比例在死亡組（3.97±2.21％）高于生存組（2.25±0.78％），但無(wú)明顯差異(P＞0.05)。RORγt、RORα水平和外周血Th17細(xì)胞亞群比例在HBeAg陽(yáng)性和HBeAg陰性患者中無(wú)明顯差

20、異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 我們的研究結(jié)果進(jìn)一步表明，在慢加急性重型乙型病毒性肝炎的異常免疫反應(yīng)中，Th17細(xì)胞在發(fā)病中具有重要的作用;研究首次表明，RORγt和RORα在慢加急性重型乙型病毒性肝炎的發(fā)病過(guò)程中可能具有重要作用，RORγt與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，可能作為判斷慢加急性重型乙型病毒性肝炎疾病預(yù)后情況的因子之一。
　　 第三部分：RORα和RORγt在原發(fā)性肝癌患者中的表達(dá)及意義

21、　　 原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤之一。原發(fā)性肝癌約90％以上為肝細(xì)胞肝癌，5％左右為膽管細(xì)胞肝癌，兩者混合的肝癌罕見(jiàn)。本病病因和發(fā)病機(jī)制尚未確定，我國(guó)肝癌患者中約90％有乙型肝炎病毒(HBV)感染背景。原發(fā)性肝癌死亡率高，我國(guó)每年死于肝癌的人數(shù)超過(guò)11萬(wàn)，在惡性腫瘤死亡順位中僅次于胃癌、食道癌而居第三位。
　　 肝癌患者體內(nèi)細(xì)胞免疫功能受損，抗腫瘤能力下降，可能是肝癌患者抗腫瘤免疫應(yīng)答缺陷的機(jī)制之一。近年來(lái)，Th17在腫瘤發(fā)

22、病機(jī)制的研究受到越來(lái)越多人的重視。有研究認(rèn)為Th17促進(jìn)腫瘤發(fā)展，也有研究認(rèn)為Th17可以清除腫瘤細(xì)胞。多項(xiàng)研究提供的證據(jù)表明RORs在癌癥中的作用，RORs表達(dá)或活性的改變可能會(huì)導(dǎo)致Th17細(xì)胞及其產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子的變化，從而正向或負(fù)向地影響癌癥的發(fā)展。
　　 在我們的前兩部分實(shí)驗(yàn)中，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在慢性乙型肝炎、ACHBLF的異常免疫反應(yīng)中，Th17細(xì)胞亞群比例增加具有重要的作用;研究首次表明，作為Th17細(xì)胞分化的重要調(diào)節(jié)

23、因子，RORγt在慢性乙型肝炎的疾病進(jìn)展過(guò)程中可能具有重要作用。本研究有助于我們揭示Th17和RORγt在肝癌中所起到的作用以及與疾病進(jìn)展的關(guān)系，從而為臨床治療提供理論依據(jù)和新的途徑。
　　 目的：
　　 本研究的目的是通過(guò)對(duì)原發(fā)性肝癌患者外周血RORγt和RORα基因表達(dá)，Th17細(xì)胞亞群及血清細(xì)胞因子的檢測(cè)，進(jìn)一步探討RORγt和RORα在原發(fā)性肝癌患者發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 方法：
　　 應(yīng)用三色

24、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)原發(fā)性肝癌患者和正常對(duì)照外周血中Th17細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的比例。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)RORγt和RORα在原發(fā)性肝癌患者和正常對(duì)照外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中的表達(dá)。應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測(cè)原發(fā)性肝癌患者和正常對(duì)照血清中IL-6，TGF-β，IL-17，IL-23和IFN-γ的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1、原發(fā)性肝癌患者外周血Th17細(xì)胞亞群比例（3.58±1.07％）明

25、顯高于慢性乙型肝炎患者(1.77±0.52％，P＜0.05)和正常對(duì)照組(0.33±0.15％，P＜0.01)。
　　 2、原發(fā)性肝癌患者外周血RORα的mRNA水平(9.96×10-2±3.74×10-2)明顯高于慢性乙型肝炎患者(6.442×10-2±3.17×10-2，P＜0.05)和正常對(duì)照組(1.666×10-3±8.77×104，P＜0.05)，原發(fā)性肝癌患者外周血RORγt的mRNA水平(1.32×10-2±2.0

26、8×10-3)明顯高于慢性乙型肝炎患者(1.217×103±0.787×10-3，P＜0.05)和正常對(duì)照組(3.207×10-4±1.38×10-4,P＜0.01)。
　　 3、原發(fā)性肝癌患者血清IL-6水平(34.86±3.02pg/ml)較慢性乙型肝炎患者(13.36±3.79pg/ml)和正常對(duì)照組明顯升高(3.43±0.55pg/ml，P＜0.01);血清TGF-β水平(44.95±11.16ng/ml)較慢性乙型肝炎

27、患者(35.22±2.4ng/ml，P＜0.05)和正常對(duì)照組明顯升高（18.28±1.8ng/ml，P＜0.01）;原發(fā)性肝癌患者血清IFN-γ水平(12.8±3.49pg/ml)較慢性乙型肝炎患者(10.17±3.38pg/ml)明顯升高(P＜0.05)，但較正常對(duì)照組明顯降低（17.14±2.28pg/ml，P＜0.05）;原發(fā)性肝癌患者血清IL-17和IL-23水平(71.24±6.43pg/ml，56.38±6.49pg/ml

28、)較慢性乙型肝炎患者(65.38±11.65pg/ml，51.10±6.69pg/ml)和正常對(duì)照組(61.07±8.84pg/ml，45.87±4.47pg/ml)無(wú)明顯差異(P≥0.05)。
　　 4、在原發(fā)性肝癌患者中，RORγt、IL-6與Th17細(xì)胞亞群比例存在明顯的正相關(guān)性(r=0.396，P=0.049;r=0.402，P=0.047)，RORα、TGF-β、IL-23、IFN-γ與Th17細(xì)胞亞群比例無(wú)相關(guān)性(r

29、=0.126，P=0.548;r=0.143，P=0.496;r=0.247，P=0.234;r=0.310，P=0.132)。
　　 5、按照TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，將原發(fā)性肝癌患者分為Ⅰ期5例，Ⅱ期6例，Ⅲ期12例，Ⅳ期7例，結(jié)果顯示RORγt和RORα水平隨著疾病的進(jìn)展逐漸上升，但無(wú)明顯差異(P＞0.05)，分別為Ⅰ期(7.75×10-3±0.94×10-3，7.60×10-2±2.0×10-2)，Ⅱ期(1.28×10-2±0.5

30、0×10-2,8.43×10-2±3.78×10-2),Ⅲ期(1.47×10-2±0.75×10-2,1.02×10-1±5.95×10-2)，Ⅳ期(1.86×10-2±0.83×10-2，1.28×10-1±8.06×10-2)。外周血Th17細(xì)胞亞群比例同樣隨著疾病的進(jìn)展逐漸上升，分別為Ⅰ期(3.28±0.36％)，Ⅱ期(4.00±1.51％)，Ⅲ期(4.14±0.77％)，Ⅳ期（4.35±1.37％），無(wú)明顯差異(P＞0.05)。

31、根據(jù)患者的病情，將原發(fā)性肝癌患者分為肝功能代償組和肝功能失代償組，發(fā)現(xiàn)失代償組患者RORγt和RORα水平(1.48×10-2±0.66×10-2，1.11×10-1±6.19×10-2)高于代償組(1.38×10-2±0.6×10-2，8×10-2±3.16×10-2)，但無(wú)明顯差異(P＞0.05)。外周血Th17細(xì)胞亞群比例在失代償組（4.58±1.21％）高于代償組(3.48±0.59％)，有明顯差異(P＜0.05)。RORγt、

32、RORα水平在HBeAg陽(yáng)性的HCC患者分別為(1.46×10-2±0.46×10-2，1.04×10-1±6.08×10-2)，與HBeAg陰性患者相比(1.17×10-2±0.66×10-2，9.50×10-2±5.58×10-2)，無(wú)明顯差異(P＞0.05)。外周血Th17細(xì)胞亞群比例在HBeAg陽(yáng)性患者（4.06±1.01％）和HBeAg陰性患者（3.91±1.16％）無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：