視網(wǎng)膜變性致病基因CERKL的功能研究.pdf

1、視覺在人類的日常生活中起到了至關(guān)重要的作用，視覺損傷嚴(yán)重影響了人類的生活質(zhì)量。視網(wǎng)膜色素變性是一類具有高度遺傳異質(zhì)性的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為夜盲，進行性的視野損傷，是人類遺傳性致盲的主要原因之一。由于對視網(wǎng)膜色素變性的病理機制缺乏深入的認(rèn)識，該疾病仍沒有有效的治療方法。因此，在篩選新的視網(wǎng)膜色素變性致病基因的基礎(chǔ)上，進一步研究致病基因的功能以及這些基因的突變導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素變性的分子機制，將為疾病的治療以及藥物篩選提供理論依據(jù)。

2、>　　CERKL是2004年克隆出來的重要的視網(wǎng)膜變性致病基因，約占隱性遺傳的視網(wǎng)膜變性的5％。到目前為止，CERKL在視網(wǎng)膜中的生理功能以及CERKL突變導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素變性的具體分子機制仍不清楚。本論文研究CERKL在視網(wǎng)膜來源的細(xì)胞中以及斑馬魚的視網(wǎng)膜中的定位，分析CERKL與微管骨架的關(guān)系，并研究了CERKL與金屬蛋白酶BMP1的相互作用。
　　在ARPE-19細(xì)胞和RGC-5細(xì)胞中，我們觀察到CERKL蛋白具有復(fù)雜的定位情

3、況，包括：細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核以及核仁。在相同培養(yǎng)條件下，CERKL蛋白的定位存在細(xì)胞特異性，在一部分細(xì)胞中CERKL蛋白顯著地定位于細(xì)胞核中(N>C)，而在另一部分的細(xì)胞中CERKL蛋白均勻地分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核(N=C)，在極少數(shù)的細(xì)胞中CERKL僅定位于細(xì)胞質(zhì)中(N

4、RKL蛋白完全不能進入細(xì)胞核，還導(dǎo)致CERKL蛋白表達(dá)水平顯著下降提示CERK L進入細(xì)胞核能抑制它的降解。為了探討C125W突變引起CERK L降解的可能途徑，分別用蛋白酶體抑制劑MG132和乳胞素以及溶酶體抑制劑Chl進行處理，但發(fā)現(xiàn)三者都不能有效的抑制C125W突變造成CERKL蛋白表達(dá)下降。
　　在斑馬魚視網(wǎng)膜中中，存在視桿細(xì)胞和4種視錐細(xì)胞，包括紅色視錐、綠色視錐，藍(lán)色視錐和UV視錐。通過觀察CERKL抗體與紅綠視錐細(xì)胞

5、的標(biāo)志蛋白Zpr-1的共定位，我們發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)CERKL定位于紅綠視錐細(xì)胞中。
　　我們發(fā)現(xiàn)CERKL蛋白與細(xì)胞周期存在著關(guān)聯(lián)，并與tubulin部分共定位。在M期時，CERKL蛋白與細(xì)胞的微管結(jié)構(gòu)部分共定位。通過co-IP實驗，我們證實了CERKL蛋白與α-tubulin存在相互作用。同時我們發(fā)現(xiàn)在CERKL-/-的斑馬魚中，ac-tubulin的水平明顯低于野生型的斑馬魚，提示CERKL蛋白可能具有穩(wěn)定微管骨架的作用。
　　

6、通過酵母雙雜交實驗，我們發(fā)現(xiàn)CERK L可能與BMP1相互作用。co-IP和亞細(xì)胞共定位實驗證實兩者在細(xì)胞質(zhì)中存在相互作用。對BMP1蛋白按結(jié)構(gòu)域進行截短，尋找BMP1蛋白中與CERKL蛋白相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示BMP1蛋白的C端的結(jié)構(gòu)域的缺失對于兩者的相互作用沒有影響。同時CERKL的致病突變R106S和C125W也不影響兩者的相互作用。在斑馬魚中，我們檢測了BMP1的同源基因BMP1b的時空表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)BMP1b主要在斑馬

7、魚發(fā)育早期表達(dá)，到36hpf時表達(dá)變得十分微弱，在成年的斑馬魚的眼睛和脾臟組織中有高表達(dá)，而在心臟以及肝臟中表達(dá)則較微弱，說明BMP1b可能在眼睛中具有重要的生理功能。通過talen技術(shù)我們構(gòu)建BMP1b基因的敲除斑馬魚，目前已經(jīng)篩選得到了兩種不同突變類型的BMP1b基因的斑馬魚，分別為：c.71-78delCAGGTCCA和c.75-77insAGG。
　　通過上述的研究，我們發(fā)現(xiàn)CERKL蛋白的亞細(xì)胞定位十分復(fù)雜，其進出細(xì)胞核