無機(jī)鹽和葡萄糖對廣州管圓線蟲三期幼蟲的體外趨化作用研究.pdf

1、廣州管圓線蟲（Angiostrongylus cantonensis, AC）是引起人體嗜酸性粒細(xì)胞增多性腦膜炎或腦膜腦炎（亦稱為廣州管圓線蟲?。┑闹匾≡w。一般而言，人類生食或半生食帶有AC感染期幼蟲(三期幼蟲，L3)的水產(chǎn)或蔬果而感染廣州管圓線蟲病。廣州管圓線蟲病散發(fā)流行于熱帶與亞熱帶地區(qū)，主要的病例報道集中在南太平洋諸島、東南亞、中國等國家及地區(qū)。直至2011年，中國（包括港臺地區(qū)）已有超過1000例廣州管圓線蟲病病例報告。近年

2、來，隨著該病疫源地的擴(kuò)大、人們膳食結(jié)構(gòu)的改變，而且人類的各種文化交流的日益頻繁，該病的發(fā)病人數(shù)持續(xù)上升，甚至連非疫源地的地區(qū)（如歐洲，北美地區(qū)）也出現(xiàn)零星病例報告。廣州管圓線蟲病已給人類健康、公共衛(wèi)生和社會安定帶來嚴(yán)重危害，引起了政府部門的高度重視和社會的廣泛關(guān)注。然而，作為一種新發(fā)傳染病，廣州管圓線蟲病許多病原生物學(xué)特性和機(jī)制還不清楚，廣州管圓線蟲病的防制工作面臨極大的挑戰(zhàn)。
　　 在線蟲家族中，已發(fā)現(xiàn)多種線蟲有不同程度的化學(xué)

3、趨向性。作為線蟲模式生物的秀麗隱桿線蟲，在化學(xué)趨避活動觀察及其神經(jīng)元參與通路和作用已經(jīng)達(dá)到一定的深度。Bargmann認(rèn)為神經(jīng)元趨化作用在秀麗隱桿線蟲的趨化活動與外部環(huán)境感知、覓食、生長發(fā)育、凋亡、活動導(dǎo)航等行為有關(guān)。經(jīng)過數(shù)百種化學(xué)物質(zhì)的篩選，Ward總結(jié)出5類秀麗隱桿線蟲的吸引劑:（一）環(huán)核苷酸:cAMP，cGMP等;（二）陰離子:Cl-，Br-，I-等;（三）陽離子:Na+，Li+，K+，Mg2+等;（四）OH-;（五）其他:賴氨酸

4、，組氨酸，半胱氨酸等。Tobata-Kudo等證實(shí)在NaCl梯度濃度平板上鼠類圓線蟲L3幼蟲具有吸引作用的梯度范圍為20mM～230mM，其中80mM區(qū)域尤為適應(yīng)。Koga通過對鼠類圓線蟲幼蟲的化學(xué)趨化性及大鼠體內(nèi)移行的研究，發(fā)現(xiàn)幼蟲在到達(dá)小腸發(fā)育為成蟲之前必然會途經(jīng)腦部，并在體外實(shí)驗(yàn)中見幼蟲對Na+以及血清白蛋白具有趨向性。Forbes等發(fā)現(xiàn)低濃度的NaCl可吸引糞類圓線蟲感染期幼蟲，而高濃度的NaCl對糞類圓線蟲又有驅(qū)避作用。Ada

5、chi等發(fā)現(xiàn)秀麗隱桿線蟲對氯化鈉或異戊醇均有趨向性，且化學(xué)趨向性隨著溫度的增加而增強(qiáng)。Kusaba等發(fā)現(xiàn)許多動物（包括哺乳類，爬行類，魚類以及無脊椎動物）的血清或血液對彭亨布魯絲蟲(Brugia pahangi)感染期幼蟲具有顯著的趨化活性，趨化指數(shù)(C.I.)達(dá)0.562～0.960（經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化），而生理鹽水對照組的C.I.僅為0.045（經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化）。Liao等證實(shí)秀麗隱桿線蟲對稀釋至1000倍后的丙酮、2-丁酮、硝基甲烷、環(huán)己酮、RD

6、X、烏洛托品等6種化合物有趨向性，而對稀釋至1000倍后的H2O2、高氯酸鉀、硫和硝化鉀等4種化合物有驅(qū)避性;其中H2O2稀釋100倍后仍具有驅(qū)避作用。
　　 AC感染大鼠等適宜宿主后，L3穿過腸壁經(jīng)血腦屏障移行入腦，經(jīng)過一定發(fā)育過程后，將再次經(jīng)血腦屏障移行至肺動脈發(fā)育為成蟲;AC L3感染人、小鼠等非適宜宿主后，幼蟲穿過腸壁經(jīng)血腦屏障移行入腦并停留在腦內(nèi)?？梢?，幼蟲進(jìn)入宿主腦內(nèi)是其生活史中不可缺少的過程。什么因素驅(qū)使了廣州管圓

7、線蟲幼蟲的腸-腦-肺趨向性移行？研究發(fā)現(xiàn)秀麗隱桿線蟲對氯化鈉或異戊醇均有趨向性。低濃度的氯化鈉可引誘糞類圓線蟲感染性幼蟲，而高濃度的氯化鈉對幼蟲有驅(qū)避作用。在相似領(lǐng)域中，尚未見有關(guān)廣州管圓線蟲幼蟲化學(xué)趨向活動的文獻(xiàn)或者實(shí)驗(yàn)報道。
　　 目的:
　　 本研究以不同濃度倍數(shù)（1、3、5、10倍）人工腦脊液以及不同濃度(20mM、50mM、100mM和150mM)的無機(jī)鹽與葡萄糖對廣州管圓線蟲三期幼蟲進(jìn)行體外趨化實(shí)驗(yàn)，并在體視

8、顯微鏡下觀察對AC L3幼蟲的趨化效果。并根據(jù)上述不同溶液在趨化平板中溶液區(qū)和對照區(qū)的AC L3數(shù)進(jìn)行人工收集并通過統(tǒng)計(jì)分析，最終總結(jié)出不同濃度倍數(shù)人工腦脊液以及不同濃度的無機(jī)鹽與葡萄糖對AC L3的趨向活動一般影響規(guī)律。
　　 方法:
　　 1.廣州管圓線蟲感染宿主模型建立:取洗凈的綠葉蔬菜2～3葉置于搪瓷方盤內(nèi)，完成感染的白玉蝸牛(Achatina fulica)置于蔬菜上。盤內(nèi)需留置少量蒸餾水，水位以剛剛浸沒蔬菜為

9、宜，同時加蓋以防白玉蝸牛上爬而影響AC幼蟲收獲效果。白玉蝸牛室溫下自由活動2～4h后，收集方盤內(nèi)所有液體和粘液以及對方盤內(nèi)蔬菜表面稍作沖洗的蒸餾水，2500r/min離心5min，去上清;用蒸餾水洗滌沉淀，2500 r/min離心5min，重復(fù)2次。取沉渣解剖鏡下分離3期幼蟲。取活力良好的3期幼蟲，解剖鏡下計(jì)數(shù)后分裝。所獲幼蟲用三蒸水洗滌兩次。以其中每只100條廣州管圓線蟲感染期幼蟲感染大鼠，成功建立廣州管圓線蟲感染大鼠動物模型并建立實(shí)

10、驗(yàn)室AC感染循環(huán)。
　　 2.趨向?qū)嶒?yàn)的實(shí)施:取離心后重懸的ACL320～30μl置趨化平皿的中心，室溫避光孵化8小時后，在解剖鏡下計(jì)數(shù)試驗(yàn)區(qū)與對照區(qū)內(nèi)的幼蟲（緩沖區(qū)的幼蟲不計(jì)入）。為避免操作誤差，每種濃度的溶液平行做3個趨化平皿。為便于鏡下準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，于平皿底部放置一張小方格紙片，每個平板幼蟲計(jì)數(shù)三次，取其平均值。
　　 3.趨化指數(shù)（chemotaxis index，C.I.）的計(jì)算:趨化指數(shù)是一項(xiàng)描述線蟲在不同外在環(huán)

11、境因素的影響下趨勢活動程度的常用衡量指標(biāo)。若C.I.∈（0，1]，表示相較于三蒸水，溶液區(qū)該濃度溶液對AC L3具有吸引作用;若C.I.∈[-1，0），則表示相較于三蒸水，溶液區(qū)該濃度溶液對AC L3具有趨避作用;若C.I.=0，表示AC L3在作隨機(jī)自由活動，溶液區(qū)和三蒸水區(qū)均無特異性作用。并將C.I.根據(jù)下列4個方面進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較:
　　 1)不同濃度倍數(shù)人工腦脊液的趨向活動比較;
　　 2)同一濃度不同無機(jī)鹽與葡萄

12、糖的趨向活動比較;
　　 3)同一無機(jī)鹽與葡萄糖溶劑不同濃度的趨向活動比較;
　　 4)按離子作用區(qū)分的趨向活動比較。
　　 4.本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（(X)±SD）表示。SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包進(jìn)行各組數(shù)據(jù)的醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)。溶液組和三蒸水組的原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若兩組差值服從正態(tài)分布(P＞0.05)，則采用配對t檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;若兩組差值不服從正態(tài)分布(P≤0.05)，則采用Wilco

13、xon符號秩和檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。顯著性水平為P≤0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1.5倍ACSF溶液對AC L3有吸引作用。
　　 2.按濃度區(qū)分:在1.0cm范圍內(nèi)，20mM KCl、Na2HPO4、NaHCO3、MgCl2等溶液對AC L3有吸引作用;50mM NaCl溶液對AC L3有吸引作用;100mM KCl溶液對AC L3有驅(qū)避作用，同濃度的CaCl2溶液對AC L3有吸引作用;150mMNaCl

14、溶液對AC L3有驅(qū)避作用，該濃度的KCl、NaHCO3、MgCl2溶液對AC L3有吸引作用。
　　 3.按溶劑區(qū)分:在1.0cm范圍內(nèi)，KCl溶液在20mM、150mM濃度時有吸引作用，在100mM濃度時有驅(qū)避作用;NaCl溶液在50mM濃度時有吸引作用，150mM濃度時有驅(qū)避作用;Na2HPO4溶液在20mM濃度時有吸引作用;NaHCO3溶液在20mM、150mM濃度時有吸引作用;CaCl2溶液在100mM濃度時有吸引作用

15、;MgCl2溶液在20mM、150mM濃度時有吸引作用。
　　 4.按離子作用區(qū)分:在1.0cm范圍內(nèi)，K+離子溶液在20mM、150mM濃度時有吸引作用，在100mM濃度時有驅(qū)避作用;Na+離子溶液在40mM、50mM濃度時有吸引作用;Cl-離子溶液在200mM濃度時有吸引作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.ACSF溶液對廣州管圓線蟲三期幼蟲具有一定的趨化作用，并且與ACSF溶液的濃度相關(guān)。
　　 2.Na