廣州管圓線蟲：溫州市疫源地的調(diào)查及Ⅴ期幼蟲cDNA文庫構建.pdf

1、廣州管圓線蟲病，亦稱嗜酸性粒細胞增多性腦膜炎或腦膜腦炎(eosinophilicmeningitisormeningoencephalitis，EM)，系病原體廣州管圓線蟲(Angiostrongyluscantonensis)V期幼蟲侵害人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)而引起。本病主要在東南亞、太平洋各島嶼及我國東南沿海流行。2003年廣州管圓線蟲病被衛(wèi)生部列為我國新發(fā)傳染病。目前，廣州管圓線蟲病的確診主要靠從病人腦脊液中查到蟲體，但檢獲率很低，約為

2、10％。通常該病的診斷需依靠臨床癥狀、流行病學資料和免疫診斷。因此，建立有效的免疫診斷方法對于該病的防治有極其重要的意義。本課題旨在通過構建廣州管圓線蟲V期幼蟲的cDNA文庫，為獲取廣州管圓線蟲期特異性的免疫抗原，建立敏感高效的免疫檢測手段和分子生物學技術提供材料來源。 研究目的： 本課題通過對溫州及周邊地區(qū)福壽螺采集和建立廣州管圓線蟲病的動物模型入手，首先對溫州及周邊地區(qū)進行了廣州管圓線蟲疫源地的分級，為廣州管圓線蟲的

3、流行病學調(diào)查提供了理論依據(jù)。再者，通過感染的動物模型獲取V期幼蟲，構建高質(zhì)量的cDNA文庫，為進一步研究廣州管圓線蟲病，尋找特異性的診斷抗原，提高廣州管圓線蟲病的診斷技術，建立有效的免疫檢測或分子生物學檢測手段奠定基礎。 實驗方法： 一、廣州管圓線蟲中間宿主(福壽螺)的采集及疫源地的分級 在溫州市及周邊地區(qū)，選擇近居民區(qū)，尤其是垃圾場附近的水塘、溝渠、草坡等環(huán)境，捕捉收集福壽螺。分別用不同的檢測方法檢測福壽螺體內(nèi)

4、的Ⅲ期幼蟲，比較各種方法的優(yōu)缺點；并用相對簡單有效的檢測方法對各個地區(qū)按文獻的方法進行疫源地的分級。 二、廣州管圓線蟲Ⅴ期幼蟲cDNA文庫的構建及文庫的初步鑒定 1、廣州管圓線蟲Ⅴ期幼蟲總RNA的提?。篢RIzol法 2、廣州管圓線蟲Ⅴ期幼蟲cDNA文庫的構建：參照Clontech公司的SMARTcDNAlibraryconstructionkit操作 3、文庫PCR鑒定 結果： 1、從廣

5、州管圓線蟲的中間宿主福壽螺中分離出廣州管圓線蟲Ⅲ期幼蟲，其形態(tài)符合文獻所述： 2、成功建立了3種檢測廣州管圓線蟲中間宿主Ⅲ期幼蟲的方法，并對其進行了比較和分析； 3、通過對溫州及周邊地區(qū)疫源地的調(diào)查并對各地進行了疫源地的分級，分級顯示蒼南縣為Ⅳ級，永嘉縣為Ⅲ級，溫州市區(qū)為Ⅰ級，基本反映了當?shù)氐囊咴吹厮健?4、成功的建立了廣州管圓線蟲動物感染模型，并成功獲取了廣州管圓線蟲Ⅴ期，與文獻所述的形態(tài)相符。 5、

6、廣州管圓線蟲Ⅴ期幼蟲的總RNA的提取完整、無降解、雜質(zhì)少；0D260/OD280=1.879(OD260=0.0853，0D280=0.0454)，RNA濃度340μg/ml。 6、成功構建一個高質(zhì)量的廣州管圓線蟲V期幼蟲cDNA文庫：未擴增文庫滴度8.49×10～6fu/ml，重組效率達99.8％，擴增文庫滴度5×109pfu/ml。 結論： 本實驗比較了檢測廣州管圓線蟲中間宿主的各種方法，進行了初步的評價；對