大鼠與小鼠腦內(nèi)廣州管圓線蟲幼蟲的形態(tài)與功能研究.pdf

1、研究背景：
　　廣州管圓線蟲(Angiostrongylus cantonesis,AC)是一種神經(jīng)系統(tǒng)和肺寄生蟲，通常生活在正常宿主（大鼠）的肺動(dòng)脈中。經(jīng)過大約一周的時(shí)間，成蟲排的卵在肺中孵化。卵及一期幼蟲在糞便中被排泄，而這些幼蟲有可能以某些軟體動(dòng)物作為中間宿主，從而發(fā)育成三期幼蟲，食用攜帶三期幼蟲軟體動(dòng)物后的大鼠，幼蟲將進(jìn)入其血液循環(huán)到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，然后經(jīng)過兩次脫髓鞘成為幼齡童蟲，一旦到達(dá)肺動(dòng)脈分支，它們生長(zhǎng)成為成蟲并開始

2、排卵，感染后42天時(shí)可從大鼠糞便中收集到一期幼蟲。而其非正常宿主比如:小鼠，豚鼠，兔子，獼猴和人類，被感染后幼蟲將遷移到大腦，不能從腦內(nèi)鉆出進(jìn)入心臟和肺部發(fā)育成熟。廣州管圓線蟲病從東南亞傳播到南太平洋、非洲、印度、菲律賓等國(guó)家和地區(qū)，報(bào)道病例已超過3000例，隨著人們飲食習(xí)慣的改變以及淡水螺在我國(guó)南方地區(qū)的區(qū)域性擴(kuò)散，廣州管圓線蟲病已成為我國(guó)部分地區(qū)最具潛在危險(xiǎn)的食源性寄生蟲病之一。
　　廣州管圓線蟲感染正常宿主和非正常宿主后其發(fā)

3、育過程不同，是否是其自身結(jié)構(gòu)以及重要器官在發(fā)育過程中的不同造成了廣州管圓線蟲不能自行穿透非正宿主的腦部入肺發(fā)育成熟？它們?cè)谙x體發(fā)育過程中有何變化？這些問題目前還未見報(bào)道。
　　研究認(rèn)為入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)是廣州管圓線蟲幼蟲發(fā)育的關(guān)鍵階段，其入侵宿主造成損傷的機(jī)制與多種因素有關(guān)，除蟲體遷徙引起組織機(jī)械性損傷和蟲體占位導(dǎo)致組織擠壓損傷外，幼蟲排泄分泌的代謝產(chǎn)物對(duì)自身移行也有很重要的作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，廣州管圓線蟲感染后，在移行過程中會(huì)分泌排

4、泄水解蛋白，基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)MMP-9可從腦脊液嗜酸性粒細(xì)胞中釋放出來(lái)，并與嗜酸性腦膜炎相關(guān)聯(lián)。在宿主的蛋白水解酶中，纖溶酶原/纖溶酶系統(tǒng)是由無(wú)活性的纖溶酶原組成，其可被尿激酶或組織形纖溶酶之一激活。酶系統(tǒng)參與基質(zhì)金屬蛋白酶酶原活化的過程。該蛋白酶在許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有致病作用?；|(zhì)金屬蛋白酶的明膠酶家族中，MMP-2（明膠酶A）和MMP-9（明膠酶B），有代謝Ⅳ，Ⅴ，Ⅶ

5、，Ⅹ，and Ⅺ型膠原蛋白的能力。tPA，uPA，MMP-2，and MMP-9的活性可以在腦脊液中被準(zhǔn)確的測(cè)量，對(duì)這些酶的評(píng)估可能有助于對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)病理變化的研究。據(jù)之前的研究表明tPA，uPA可能在BALB/c小鼠嗜酸性腦膜炎中起到作用，另外MMP-9也與小鼠嗜酸性腦膜炎有關(guān)。酶是廣州管圓線蟲感染BALB/c和ICR小鼠腦膜炎的一個(gè)有用的標(biāo)記物。ICR小鼠同KM小鼠同屬一種屬，同為非正常宿主，一般來(lái)說，廣州管圓線蟲只能在正常宿主體內(nèi)生

6、長(zhǎng)并發(fā)育至性成熟。目前還沒有確鑿的證據(jù)證實(shí)宿主的免疫反應(yīng)與基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)的強(qiáng)度相關(guān)。分泌蛋白酶的不同是否是造成廣州管圓線蟲在正常宿主和非正常宿主移行結(jié)局的不同？其作用如何？發(fā)揮作用的機(jī)制具體有哪些？與蟲體自身發(fā)育是否有關(guān)？這些問題尚不明確。
　　廣州管圓線蟲病作為一種新發(fā)流行病，在我國(guó)多次爆發(fā)流行，并已成為重要的公共衛(wèi)生問題得到重視。診斷在廣州管圓線蟲病的防治中起到關(guān)鍵作用，但由于病原學(xué)檢測(cè)的敏感性低，免疫學(xué)檢測(cè)成為該病的重要

7、輔助診斷方法。廣州管圓線蟲與其他寄生蟲抗原存在交叉反應(yīng)性，近年來(lái)對(duì)廣州管圓線蟲診斷抗原的分析取得了較大的進(jìn)展;而Maleewong等純化的雌童蟲Mr29000、Chye等純化的5期幼蟲Mr204000、Eamsobhan等純化的Mr31000和Wongkham等純化的Mr31500抗原均提高了對(duì)廣州管圓線蟲檢測(cè)的敏感性和特異性，但是其抗原來(lái)源的獲得比較復(fù)雜。對(duì)廣州管圓線蟲感染正常宿主和非正常宿主體，進(jìn)行體外培養(yǎng)，收集其在不同宿主腦內(nèi)的分

8、泌蛋白酶，是否具有很好的診斷價(jià)值？能否提高診斷的敏感性和特異性？尚無(wú)關(guān)于廣州管圓線蟲幼蟲分泌代謝抗原用于診斷的報(bào)道。
　　目的：
　　1.通過建立廣州管圓線蟲感染大鼠和小鼠動(dòng)物模型后光鏡下觀察測(cè)量比較大鼠和小鼠腦內(nèi)感染后第21天幼蟲結(jié)構(gòu)，掃描電鏡下觀察不同宿主腦內(nèi)幼蟲與發(fā)育相關(guān)的結(jié)構(gòu)。
　　2.廣州管圓線蟲感染大鼠和小鼠第21天幼蟲進(jìn)行體外培養(yǎng)，對(duì)幼蟲及收集濃縮排泄分泌產(chǎn)物，進(jìn)行蛋白譜分析。
　　3.探討小鼠腦內(nèi)

9、幼蟲分泌抗原診斷價(jià)值。
　　方法：
　　1.廣州管圓線蟲感染宿主模型建立觀察以及幼蟲相關(guān)結(jié)構(gòu)觀察:使用含1.5g胃蛋白酶人工消化液，37℃消化被廣州管圓線蟲三期幼蟲(L3)感染的白玉蝸牛，2小時(shí)后，80目塞網(wǎng)過濾去除組織碎屑，以PBS洗滌濾液3次，靜置自然沉淀后收集沉渣中幼蟲，以其中50條廣州管圓線蟲感染期幼蟲感染大鼠和小鼠，成功建立廣州管圓線蟲感染大鼠和小鼠動(dòng)物模型。大鼠感染模型使用SD大鼠，小鼠使用昆明小鼠以及BALB/

10、c小鼠，模型建立后觀察兩種宿主生活狀態(tài)以及感染后癥狀體征變化;到21dpi解剖采集兩種宿主腦中的幼蟲，掃描電鏡觀察分析兩種宿主蟲體感覺乳突及化學(xué)感受器的差異，光鏡觀察兩種宿主腦內(nèi)幼蟲體長(zhǎng)、體寬及咽腸比例并分析其差異。
　　2.廣州管圓線蟲排泄分泌物相關(guān)蛋白酶譜分析:感染動(dòng)物模型建立后，取大鼠和小鼠(BALB/c)感染后第21天幼蟲進(jìn)行體外培養(yǎng)，獲得幼蟲分泌排泄物。蛋白酶譜分析兩種宿主分泌蛋白的差異。
　　3.LESA對(duì)早期廣

11、州管圓線蟲感染的診斷價(jià)值:收集小鼠腦內(nèi)幼蟲并制備幼蟲排泄分泌抗原(LESA)，用成蟲制備成蟲抗原(AWA)。將兩種抗原用于檢測(cè)感染小鼠以及人類，正常小鼠及人類的不同時(shí)間點(diǎn)的IgG和IgM變化趨勢(shì)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)比分析，明確LESA診斷廣州管圓線蟲的敏感性以及特異性。
　　4.本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。不同宿主腦內(nèi)幼蟲之間結(jié)構(gòu)比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)分析。率的比較采用卡方檢驗(yàn)，變化規(guī)律的統(tǒng)計(jì)采用方差分析的方法

12、，用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包進(jìn)行各組數(shù)據(jù)的醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)。
　　結(jié)果：
　　1.廣州管圓線蟲感染宿主模型建立觀察以及幼蟲相關(guān)結(jié)構(gòu)觀察
　　1.1、感染后宿主觀察
　　廣州管圓線蟲感染模型建立后觀察發(fā)現(xiàn):小鼠模型約自13dpi開始逐漸出現(xiàn)毛發(fā)濕潤(rùn)、脫落、脊柱后凸、偏癱、發(fā)抖和打轉(zhuǎn)等體征，癥狀持續(xù)。約16dpi時(shí)小鼠以上癥狀明顯加重并開始出現(xiàn)死亡。大鼠模型感染期間觀察只發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)脫毛癥狀，其它在小鼠模型身上出現(xiàn)的發(fā)病癥

13、狀不明顯。
　　1.2、幼蟲相關(guān)結(jié)構(gòu)觀察
　　1.2.1、電鏡觀察結(jié)果
　　21dpi解剖采集兩種宿主腦中的幼蟲，通過掃描電鏡觀察了解不同宿主腦內(nèi)蟲體結(jié)構(gòu)特征:
　　(1)通過掃描電鏡觀察蟲體頭部其口部結(jié)構(gòu)及周圍感覺乳突、化學(xué)感受器發(fā)現(xiàn)兩種宿主腦內(nèi)幼蟲均發(fā)育完全，正常宿主（SD大鼠）和非正常宿主腦內(nèi)幼蟲（BABL/c和KM兩種小鼠）經(jīng)觀察和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以上結(jié)構(gòu)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);
　　(2)掃描電

14、鏡下觀察兩種宿主腦內(nèi)蟲體尾部結(jié)構(gòu)顯示:SD大鼠以及BABL/c和KM兩種小鼠尾部結(jié)構(gòu)完整，尾部褶皺明顯，雌蟲肛門和陰門開口及雄蟲交合傘均清晰可見，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析未見差異（p＞0.05）。
　　(3)幼蟲頭部其他結(jié)構(gòu)觀察:兩種感染宿主腦內(nèi)幼蟲頭部結(jié)構(gòu)發(fā)育均已基本成熟與廣州管圓線蟲成蟲頭部掃描電鏡結(jié)構(gòu)相似;
　　1.2.2、光鏡觀察
　　21dpi解剖采集兩種宿主腦中的幼蟲，與幼蟲發(fā)育程度相關(guān)的結(jié)構(gòu)如幼蟲體長(zhǎng)體、寬及咽腸比例并

15、進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析認(rèn)為:兩種宿主腦內(nèi)幼蟲在蟲體長(zhǎng)度、寬度以及咽腸比例差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），大鼠腦內(nèi)幼蟲發(fā)育程度較小鼠腦內(nèi)幼蟲發(fā)育程度高。兩種小鼠腦內(nèi)幼蟲體長(zhǎng)、體寬及咽腸比例進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，而咽長(zhǎng)具有差異（P＜0.05)。
　　2.廣州管圓線蟲排泄分泌物相關(guān)蛋白酶譜分析
　　2.1、大鼠和小鼠腦內(nèi)21dpi幼蟲蛋白質(zhì)譜大致相同，小鼠ESP的主要條帶比大鼠ESP的主要條帶多，大小鼠的條帶具有

16、明顯差異性。
　　2.2、明膠酶譜進(jìn)一步比較兩種分泌蛋白在功能上的差異，結(jié)果出現(xiàn)了明顯的反應(yīng)條帶，但是大鼠ESP在Mr35000和Mr32000處較小鼠ESP反應(yīng)條帶更為明顯。
　　2.3、進(jìn)一步明膠酶譜分析，大鼠ESP在Mr40000～Mr35000處水解程度較小鼠ESP強(qiáng)，用不同蛋白酶抑制劑處理兩種樣品，發(fā)現(xiàn)大鼠ESP和小鼠ESP經(jīng)EDTA處理后的樣品在Mr40000～Mr35000水解區(qū)域均有所減弱，大鼠ESP條帶的減

17、弱程度更為明顯。
　　3.LESA對(duì)早期廣州管圓線蟲感染的診斷價(jià)值
　　將收集濃縮的分泌蛋白作為抗原包被酶標(biāo)板，然后將該酶標(biāo)板以及全蟲抗原酶標(biāo)板分別與免疫小鼠血清反應(yīng)。檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)IgG和IgM變化趨勢(shì)顯示感染后第5天抗體水平達(dá)到高峰且高峰可持續(xù)到第10天，之后峰線出現(xiàn)波動(dòng);LESA感染組IgG組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)第10天時(shí)IgG水平較第15天和第21天時(shí)高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;兩種抗原與廣州管圓線蟲病人血清反應(yīng)陽(yáng)性率檢測(cè)顯示:

18、AWA檢測(cè)敏感性較LESA稍高;同時(shí)AWA與其他寄生蟲抗原存在交叉反應(yīng)性，而LESA交叉反應(yīng)性不明顯，其中急性血吸蟲病人血清，裂頭蚴病人血清，糞類圓線蟲病人血清檢測(cè)均未出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，說明LESA可以提高檢測(cè)的特異性，作為抗原檢測(cè)方法對(duì)早期診斷具有良好的指導(dǎo)作用。
　　結(jié)論：
　　1.大鼠和小鼠腦內(nèi)幼蟲口部結(jié)構(gòu)及周圍感覺乳突、化學(xué)感受器未見差異;但二者的發(fā)育程度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.大鼠和小鼠腦內(nèi)幼蟲體外培養(yǎng)分泌的蛋