大鼠與小鼠腦內廣州管圓線蟲幼蟲的形態(tài)與功能研究.pdf

1、研究背景：
　　廣州管圓線蟲(Angiostrongylus cantonesis,AC)是一種神經(jīng)系統(tǒng)和肺寄生蟲，通常生活在正常宿主（大鼠）的肺動脈中。經(jīng)過大約一周的時間，成蟲排的卵在肺中孵化。卵及一期幼蟲在糞便中被排泄，而這些幼蟲有可能以某些軟體動物作為中間宿主，從而發(fā)育成三期幼蟲，食用攜帶三期幼蟲軟體動物后的大鼠，幼蟲將進入其血液循環(huán)到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)，然后經(jīng)過兩次脫髓鞘成為幼齡童蟲，一旦到達肺動脈分支，它們生長成為成蟲并開始

2、排卵，感染后42天時可從大鼠糞便中收集到一期幼蟲。而其非正常宿主比如:小鼠，豚鼠，兔子，獼猴和人類，被感染后幼蟲將遷移到大腦，不能從腦內鉆出進入心臟和肺部發(fā)育成熟。廣州管圓線蟲病從東南亞傳播到南太平洋、非洲、印度、菲律賓等國家和地區(qū)，報道病例已超過3000例，隨著人們飲食習慣的改變以及淡水螺在我國南方地區(qū)的區(qū)域性擴散，廣州管圓線蟲病已成為我國部分地區(qū)最具潛在危險的食源性寄生蟲病之一。
　　廣州管圓線蟲感染正常宿主和非正常宿主后其發(fā)

3、育過程不同，是否是其自身結構以及重要器官在發(fā)育過程中的不同造成了廣州管圓線蟲不能自行穿透非正宿主的腦部入肺發(fā)育成熟？它們在蟲體發(fā)育過程中有何變化？這些問題目前還未見報道。
　　研究認為入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)是廣州管圓線蟲幼蟲發(fā)育的關鍵階段，其入侵宿主造成損傷的機制與多種因素有關，除蟲體遷徙引起組織機械性損傷和蟲體占位導致組織擠壓損傷外，幼蟲排泄分泌的代謝產(chǎn)物對自身移行也有很重要的作用。據(jù)文獻報道，廣州管圓線蟲感染后，在移行過程中會分泌排

4、泄水解蛋白，基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)MMP-9可從腦脊液嗜酸性粒細胞中釋放出來，并與嗜酸性腦膜炎相關聯(lián)。在宿主的蛋白水解酶中，纖溶酶原/纖溶酶系統(tǒng)是由無活性的纖溶酶原組成，其可被尿激酶或組織形纖溶酶之一激活。酶系統(tǒng)參與基質金屬蛋白酶酶原活化的過程。該蛋白酶在許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有致病作用?；|金屬蛋白酶的明膠酶家族中，MMP-2（明膠酶A）和MMP-9（明膠酶B），有代謝Ⅳ，Ⅴ，Ⅶ

5、，Ⅹ，and Ⅺ型膠原蛋白的能力。tPA，uPA，MMP-2，and MMP-9的活性可以在腦脊液中被準確的測量，對這些酶的評估可能有助于對神經(jīng)系統(tǒng)病理變化的研究。據(jù)之前的研究表明tPA，uPA可能在BALB/c小鼠嗜酸性腦膜炎中起到作用，另外MMP-9也與小鼠嗜酸性腦膜炎有關。酶是廣州管圓線蟲感染BALB/c和ICR小鼠腦膜炎的一個有用的標記物。ICR小鼠同KM小鼠同屬一種屬，同為非正常宿主，一般來說，廣州管圓線蟲只能在正常宿主體內生

6、長并發(fā)育至性成熟。目前還沒有確鑿的證據(jù)證實宿主的免疫反應與基質金屬蛋白酶系統(tǒng)的強度相關。分泌蛋白酶的不同是否是造成廣州管圓線蟲在正常宿主和非正常宿主移行結局的不同？其作用如何？發(fā)揮作用的機制具體有哪些？與蟲體自身發(fā)育是否有關？這些問題尚不明確。
　　廣州管圓線蟲病作為一種新發(fā)流行病，在我國多次爆發(fā)流行，并已成為重要的公共衛(wèi)生問題得到重視。診斷在廣州管圓線蟲病的防治中起到關鍵作用，但由于病原學檢測的敏感性低，免疫學檢測成為該病的重要

7、輔助診斷方法。廣州管圓線蟲與其他寄生蟲抗原存在交叉反應性，近年來對廣州管圓線蟲診斷抗原的分析取得了較大的進展;而Maleewong等純化的雌童蟲Mr29000、Chye等純化的5期幼蟲Mr204000、Eamsobhan等純化的Mr31000和Wongkham等純化的Mr31500抗原均提高了對廣州管圓線蟲檢測的敏感性和特異性，但是其抗原來源的獲得比較復雜。對廣州管圓線蟲感染正常宿主和非正常宿主體，進行體外培養(yǎng)，收集其在不同宿主腦內的分

8、泌蛋白酶，是否具有很好的診斷價值？能否提高診斷的敏感性和特異性？尚無關于廣州管圓線蟲幼蟲分泌代謝抗原用于診斷的報道。
　　目的：
　　1.通過建立廣州管圓線蟲感染大鼠和小鼠動物模型后光鏡下觀察測量比較大鼠和小鼠腦內感染后第21天幼蟲結構，掃描電鏡下觀察不同宿主腦內幼蟲與發(fā)育相關的結構。
　　2.廣州管圓線蟲感染大鼠和小鼠第21天幼蟲進行體外培養(yǎng)，對幼蟲及收集濃縮排泄分泌產(chǎn)物，進行蛋白譜分析。
　　3.探討小鼠腦內

9、幼蟲分泌抗原診斷價值。
　　方法：
　　1.廣州管圓線蟲感染宿主模型建立觀察以及幼蟲相關結構觀察:使用含1.5g胃蛋白酶人工消化液，37℃消化被廣州管圓線蟲三期幼蟲(L3)感染的白玉蝸牛，2小時后，80目塞網(wǎng)過濾去除組織碎屑，以PBS洗滌濾液3次，靜置自然沉淀后收集沉渣中幼蟲，以其中50條廣州管圓線蟲感染期幼蟲感染大鼠和小鼠，成功建立廣州管圓線蟲感染大鼠和小鼠動物模型。大鼠感染模型使用SD大鼠，小鼠使用昆明小鼠以及BALB/

10、c小鼠，模型建立后觀察兩種宿主生活狀態(tài)以及感染后癥狀體征變化;到21dpi解剖采集兩種宿主腦中的幼蟲，掃描電鏡觀察分析兩種宿主蟲體感覺乳突及化學感受器的差異，光鏡觀察兩種宿主腦內幼蟲體長、體寬及咽腸比例并分析其差異。
　　2.廣州管圓線蟲排泄分泌物相關蛋白酶譜分析:感染動物模型建立后，取大鼠和小鼠(BALB/c)感染后第21天幼蟲進行體外培養(yǎng)，獲得幼蟲分泌排泄物。蛋白酶譜分析兩種宿主分泌蛋白的差異。
　　3.LESA對早期廣

11、州管圓線蟲感染的診斷價值:收集小鼠腦內幼蟲并制備幼蟲排泄分泌抗原(LESA)，用成蟲制備成蟲抗原(AWA)。將兩種抗原用于檢測感染小鼠以及人類，正常小鼠及人類的不同時間點的IgG和IgM變化趨勢，進行統(tǒng)計學對比分析，明確LESA診斷廣州管圓線蟲的敏感性以及特異性。
　　4.本實驗數(shù)據(jù)均以“均數(shù)±標準差”表示。不同宿主腦內幼蟲之間結構比較采用Kruskal-Wallis檢驗分析。率的比較采用卡方檢驗，變化規(guī)律的統(tǒng)計采用方差分析的方法

12、，用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件包進行各組數(shù)據(jù)的醫(yī)學統(tǒng)計。
　　結果：
　　1.廣州管圓線蟲感染宿主模型建立觀察以及幼蟲相關結構觀察
　　1.1、感染后宿主觀察
　　廣州管圓線蟲感染模型建立后觀察發(fā)現(xiàn):小鼠模型約自13dpi開始逐漸出現(xiàn)毛發(fā)濕潤、脫落、脊柱后凸、偏癱、發(fā)抖和打轉等體征，癥狀持續(xù)。約16dpi時小鼠以上癥狀明顯加重并開始出現(xiàn)死亡。大鼠模型感染期間觀察只發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)脫毛癥狀，其它在小鼠模型身上出現(xiàn)的發(fā)病癥

13、狀不明顯。
　　1.2、幼蟲相關結構觀察
　　1.2.1、電鏡觀察結果
　　21dpi解剖采集兩種宿主腦中的幼蟲，通過掃描電鏡觀察了解不同宿主腦內蟲體結構特征:
　　(1)通過掃描電鏡觀察蟲體頭部其口部結構及周圍感覺乳突、化學感受器發(fā)現(xiàn)兩種宿主腦內幼蟲均發(fā)育完全，正常宿主（SD大鼠）和非正常宿主腦內幼蟲（BABL/c和KM兩種小鼠）經(jīng)觀察和統(tǒng)計學分析以上結構未見統(tǒng)計學差異(P＞0.05);
　　(2)掃描電

14、鏡下觀察兩種宿主腦內蟲體尾部結構顯示:SD大鼠以及BABL/c和KM兩種小鼠尾部結構完整，尾部褶皺明顯，雌蟲肛門和陰門開口及雄蟲交合傘均清晰可見，統(tǒng)計學分析未見差異（p＞0.05）。
　　(3)幼蟲頭部其他結構觀察:兩種感染宿主腦內幼蟲頭部結構發(fā)育均已基本成熟與廣州管圓線蟲成蟲頭部掃描電鏡結構相似;
　　1.2.2、光鏡觀察
　　21dpi解剖采集兩種宿主腦中的幼蟲，與幼蟲發(fā)育程度相關的結構如幼蟲體長體、寬及咽腸比例并

15、進行統(tǒng)計學分析認為:兩種宿主腦內幼蟲在蟲體長度、寬度以及咽腸比例差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），大鼠腦內幼蟲發(fā)育程度較小鼠腦內幼蟲發(fā)育程度高。兩種小鼠腦內幼蟲體長、體寬及咽腸比例進行比較發(fā)現(xiàn)無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，而咽長具有差異（P＜0.05)。
　　2.廣州管圓線蟲排泄分泌物相關蛋白酶譜分析
　　2.1、大鼠和小鼠腦內21dpi幼蟲蛋白質譜大致相同，小鼠ESP的主要條帶比大鼠ESP的主要條帶多，大小鼠的條帶具有

16、明顯差異性。
　　2.2、明膠酶譜進一步比較兩種分泌蛋白在功能上的差異，結果出現(xiàn)了明顯的反應條帶，但是大鼠ESP在Mr35000和Mr32000處較小鼠ESP反應條帶更為明顯。
　　2.3、進一步明膠酶譜分析，大鼠ESP在Mr40000～Mr35000處水解程度較小鼠ESP強，用不同蛋白酶抑制劑處理兩種樣品，發(fā)現(xiàn)大鼠ESP和小鼠ESP經(jīng)EDTA處理后的樣品在Mr40000～Mr35000水解區(qū)域均有所減弱，大鼠ESP條帶的減

17、弱程度更為明顯。
　　3.LESA對早期廣州管圓線蟲感染的診斷價值
　　將收集濃縮的分泌蛋白作為抗原包被酶標板，然后將該酶標板以及全蟲抗原酶標板分別與免疫小鼠血清反應。檢測不同時間點IgG和IgM變化趨勢顯示感染后第5天抗體水平達到高峰且高峰可持續(xù)到第10天，之后峰線出現(xiàn)波動;LESA感染組IgG組內比較發(fā)現(xiàn)第10天時IgG水平較第15天和第21天時高，且差異具有統(tǒng)計學意義;兩種抗原與廣州管圓線蟲病人血清反應陽性率檢測顯示:

18、AWA檢測敏感性較LESA稍高;同時AWA與其他寄生蟲抗原存在交叉反應性，而LESA交叉反應性不明顯，其中急性血吸蟲病人血清，裂頭蚴病人血清，糞類圓線蟲病人血清檢測均未出現(xiàn)陽性反應，說明LESA可以提高檢測的特異性，作為抗原檢測方法對早期診斷具有良好的指導作用。
　　結論：
　　1.大鼠和小鼠腦內幼蟲口部結構及周圍感覺乳突、化學感受器未見差異;但二者的發(fā)育程度具有統(tǒng)計學差異。
　　2.大鼠和小鼠腦內幼蟲體外培養(yǎng)分泌的蛋