PEI-SPIO標記關節(jié)軟骨細胞的可行性研究.pdf

1、背景:關節(jié)軟骨損傷的治療一直是運動損傷領域的重要課題,目前的治療方法除了保守治療外有關節(jié)腔清理術、微骨折術、自體或異體骨軟骨移植術、人工關節(jié)置換術等多種治療方法,但各治療手段都存在有各自的局限性。隨著組織工程技術的發(fā)展與成熟,組織工程技術逐漸應用于越來越多的領域,應用于多個器官組織的損傷修復,自上世紀90年代,有組織工程技術應用于軟骨損傷修復的報道。在這個研究過程中,傳統(tǒng)的觀察修復效果的方法是將實驗動物處死后取實驗部位的組織,進行相關的

2、檢測和評定,這樣的方法只能觀察到最終的修復結果,無法動態(tài)的監(jiān)測在修復過程中,種子細胞的轉歸、遷徙。隨著核磁現(xiàn)象技術的發(fā)展,SPIO的研制與應用,為實現(xiàn)細胞的在體識別和可視化追蹤提供了新的方法。以往的SPIO是Resovist(dm:60nm)和feridex(dm:63nm),都是由葡聚糖包裹的SPIO,表面都呈負電荷。與細胞表面的負電荷相互排斥,使用這種SPIO在標記過程中,標記效率低下,需要與轉染劑結合后才能用于標記。PEI-SPI

3、O(polyethylenimine-superparamagnetic iron oxid)是由聚乙烯亞胺包被的表面呈正電荷的新型包被材料。由于電荷的吸引,不需要與轉染劑結合,可以大大提高標記的效率,同時聚乙烯亞胺在體內(nèi)的降解時間也要比葡聚糖時間長,可以達到更長時間的示蹤。
　　目的:用已經(jīng)掌握的技術方法,獲取豬關節(jié)軟骨細胞并進行培養(yǎng)和鑒定。證實實驗組細胞是可以分泌Ⅱ型膠原蛋白以及細胞外基質的透明軟骨細胞。再用PEI-SPIO對

4、原代培養(yǎng)的關節(jié)透明軟骨進行標記,通過研究該粒子標記細胞后對關節(jié)軟骨細胞的增值、活性和Ⅱ型膠原蛋白基因表達的影響,研究該粒子標記關節(jié)軟骨細胞的安全濃度和安全標記時間。
　　材料和方法:取1-3月齡的巴馬小香豬后膝關節(jié)透明軟骨體外培養(yǎng),培養(yǎng)至第2代細胞,制成細胞爬片后做PB染色和透射電鏡檢查,然后將PEI-SPIO用培養(yǎng)液配制成Fe濃度為2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、14μg/

5、ml的標記液,7種濃度的標記液分別標記的細胞設為實驗組,不標記的細胞設為對照組。將實驗組和對照組在培育6、12、18、24、30h后,分別通過普魯士藍染色,透射電鏡,細胞內(nèi)鐵含量,半定量RT-PCR以及WST-1檢測來探討材料對軟骨細胞的生物學特性的影響,同時研究該粒子標記關節(jié)軟骨細胞的安全濃度和安全標記時間。以及通過將PEI-SPIO移植進動物體內(nèi)后對動物重要臟器的損害的研究,來初步探討該材料的生物安全性。
　　結果:PB染色顯

6、示,幾乎所有的細胞都被藍染,藍染的部分位于細胞的細胞質,而細胞核中均無藍染,提示該粒子被細胞吞噬后位于細胞的胞質中,不存在細胞核內(nèi)。透射電鏡的結果也驗證了這一點,透射電鏡下觀察到大量的黑色致密顆粒位于細胞的胞質中,細胞核內(nèi)未見黑色致密顆粒。磁標記后濃度為6、8、10、12、14μg/ml的實驗組PS染色顯示80％以上的細胞被鐵粒子標記,標記率比較高,通過微量元素檢測儀對細胞內(nèi)鐵含量的測定,繪制成曲線發(fā)現(xiàn)SPIO標記的時間越長,細胞內(nèi)鐵含

7、量越高,在標記時間超過24h后,各實驗組的細胞內(nèi)鐵含量的曲線就趨向平緩,細胞內(nèi)鐵含量就就基本不再增加,提示細胞吞噬標記物已經(jīng)達到了飽和的狀態(tài),即使再增加標記的時間,也無法提高細胞內(nèi)鐵含量,無法提高標記效率。WST-1檢測磁顆粒的細胞毒性,未標記的細胞為對照組與標記的各個濃度的細胞為實驗組,標記24h后,用分光光度計測OD值,最后發(fā)現(xiàn)標記24h后各實驗組之間OD值無顯著差異,(P>0.05);各實驗組和對照組之間,OD值也無統(tǒng)計學差異(P

8、>0.05)。因此標記24h對于軟骨細胞來講,并不會對其活性產(chǎn)生影響。進一步的研究,對細胞分泌Ⅱ型膠原蛋白的能力進行了研究,用6、8μg/ml濃度標記的軟骨細胞,通過標記后測定半定量的RT-PCR,6μg/ml組中的標記組(27.32±1.02)和對照組(28.56±1.15)的目的條帶灰度值和內(nèi)參條帶灰度值的比值無統(tǒng)計學差異(P>0.05),而8μg/ml組中標記組(13.04±0.60)與對照組(18.89±1.26)比較有統(tǒng)計學差

9、異(P<0.05),提示6μg/ml的標記液標記24h后對透明軟骨細胞中Ⅱ型膠原蛋白基因的表達無影響,而8μg/ml的標記液標記24h后,抑制了透明軟骨細胞中Ⅱ型膠原蛋白基因的表達。PEI-SPIO移植進入體內(nèi)后,重要臟器并未出現(xiàn)明顯的病理損傷,PEI-SPIO不會對重要臟器產(chǎn)生損害。
　　結論:分離培養(yǎng)出原代的關節(jié)軟骨細胞,而且培養(yǎng)的軟骨細胞具有分泌細胞外基質和Ⅱ型膠原蛋白的能力等軟骨細胞的特性。其次PEI-SPIO可以高效的標