磁靶向移植SPIO標(biāo)記的hbMSCs修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損可行性的初步研究.pdf

1、背景：
　　 臨床上，多種原因所致的關(guān)節(jié)軟骨損傷十分常見。盡管有許多種治療措施，但尚無金標(biāo)準(zhǔn)的臨床治療路徑，文獻(xiàn)提示還不能確立哪種治療手段比其它更具優(yōu)越性。目前關(guān)于軟骨缺損的治療策略之一是移植間充質(zhì)干細(xì)胞再生修復(fù)軟骨。經(jīng)關(guān)節(jié)腔注射間充質(zhì)干細(xì)胞療法是目前最微創(chuàng)的給藥途徑之一。
　　 盡管有文獻(xiàn)報(bào)道指出這種技術(shù)可以修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷，但這種技術(shù)的修復(fù)效果并不十分理想。其主要問題在于：從注射點(diǎn)到達(dá)軟骨損傷部位存在一定的距離，缺少

2、特異的干細(xì)胞歸巢機(jī)制，干細(xì)胞主動(dòng)遷移到損傷部位的效率十分低下。此外，由于關(guān)節(jié)滑液的稀釋作用，移植的干細(xì)胞很難在損傷部位定居。最終，僅僅只有少部分移植的干細(xì)胞貼附在軟骨損傷部位發(fā)揮修復(fù)作用。大多數(shù)移植的干細(xì)胞是貼附在滑膜組織或者游離在關(guān)節(jié)液中，不僅發(fā)揮不了治療作用，反而還會(huì)誘發(fā)滑膜增生，增加滑膜炎、游離體等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。
　　 目前大多數(shù)的研究方向都是以干細(xì)胞的功能和生物學(xué)特性為焦點(diǎn)，而不是干細(xì)胞的傳遞策略。眾所周知，合適的干細(xì)胞

3、傳遞策略也是基于MSCs 發(fā)展起來的再生醫(yī)學(xué)的關(guān)鍵。因此，任何可以特異性的靶向傳遞干細(xì)胞到達(dá)目標(biāo)感興趣區(qū)域的技術(shù)將會(huì)突破經(jīng)關(guān)節(jié)腔注射間充質(zhì)干細(xì)胞療法的瓶頸，減少并發(fā)癥，增強(qiáng)修復(fù)效果，解決上述問題。
　　 目的：
　　 本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谘芯恳环N新型的細(xì)胞空間傳遞技術(shù)，利用外加磁場(chǎng)聚集SPIO 標(biāo)記的干細(xì)胞到達(dá)軟骨缺損區(qū)域，增加局部干細(xì)胞密度，節(jié)約干細(xì)胞數(shù)量。
　　 方法：
　　 1．體外SPIO 標(biāo)記hbMS

4、Cs的細(xì)胞生物學(xué)特性從骨髓中分離、培養(yǎng)hbMSCs，不同濃度SPIO(6.0μg/ml、9.0μg/ml、12.0μg/ml)與hbMSCs 孵育24h。普魯士藍(lán)染色和透射電鏡檢查鑒定胞漿內(nèi)鐵粒子;胎盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活；MTT 法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的變化。
　　 2.體外，磁力作用下SPIO 標(biāo)記的hbMSCs水平面上的聚集實(shí)驗(yàn)通過觀察SPIO 標(biāo)記的hbMSCs在外加磁力干預(yù)下的分布模式，初步評(píng)價(jià)外加磁力聚集SPIO 標(biāo)記的h

5、bMSCs 到達(dá)特定靶區(qū)的可行性。將5×103/500ul SPIO 標(biāo)記的hbMSCs 懸液接種在24孔板中心，添加1000ul 培養(yǎng)基后吹打混勻。靜置10分鐘后，在孔板中心下方（M 區(qū)：4×4mm2）安置一枚圓柱形銣鐵硼強(qiáng)力永磁鐵（直徑：4mm，高：3mm，場(chǎng)強(qiáng)：0.20T）。37°C 繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后移除磁體，光鏡下（×100倍）
　　 計(jì)數(shù)每孔中心區(qū)域（M 區(qū)）和周邊區(qū)域（P 區(qū)）的細(xì)胞數(shù)量。根據(jù)公式：細(xì)胞密度=細(xì)胞數(shù)

6、量÷分布面積，分別求出M 區(qū)細(xì)胞密度和P 區(qū)細(xì)胞密度。采用單因素方差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 3.磁力作為物理趨化因素加強(qiáng)SPIO 標(biāo)記的hbMSCs在垂直方向上的遷移實(shí)驗(yàn)。
　　 采用Transwell 雙室培養(yǎng)系統(tǒng)評(píng)價(jià)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。上室接種1×105/100ul SPIO 標(biāo)記的hbMSCs 懸液，下室添加600ul的無血清培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)組在下室底面中心的下方安置一枚圓柱形銣鐵硼強(qiáng)力永磁鐵（直徑：4mm，高：3mm，場(chǎng)強(qiáng)

7、：0.20T，對(duì)照組不放置磁鐵。37°C 繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后移除磁體，固定，結(jié)晶紫染色，隨機(jī)10個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù)目。平均值采用單因素方差分析兩組間的差異。
　　 4．體外三維立體空間，磁靶向移植SPIO 標(biāo)記的hbMSCs 到達(dá)體外構(gòu)建的關(guān)節(jié)軟骨缺損模型hbMSCs與9.0μg/ml SPIO 孵育24h，胰酶消化7×106 SPIO 標(biāo)記的hbMSCs 懸浮于300uL 培養(yǎng)基中。特制的銣鐵硼永磁體（10cm×10c

8、m×5cm，最高場(chǎng)強(qiáng)0.57T）用于產(chǎn)生磁場(chǎng)。收集新鮮的中度膝關(guān)節(jié)炎患者行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)時(shí)廢棄的截骨塊。用骨刀修剪成2cm×2cm的正方形骨軟骨塊，中心制作直徑10mm，深3mm的全層軟骨損傷。然后將骨軟骨塊用生物膠貼附在注滿PBS溶液的培養(yǎng)瓶側(cè)壁，模擬關(guān)節(jié)腔。
　　 在磁力作用下，用1ml 空針緩慢將7×106 SPIO 標(biāo)記的hbMSCs 懸液注射到培養(yǎng)瓶中，保持磁力作用90分鐘。靶向移植前和移植后90分鐘，3.0T MR

9、T2 加權(quán)自旋回波(SET2 WI)序列掃描樣本，對(duì)SPIO 標(biāo)記的hbMSCs 進(jìn)行成像示蹤。分析信號(hào)強(qiáng)度（SI）
　　 改變，并與組織學(xué)評(píng)價(jià)對(duì)照。采用兩獨(dú)立樣本t-檢驗(yàn)，p＜0.01具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果：
　　 1．體外SPIO 標(biāo)記hbMSCs細(xì)胞生物學(xué)特性95％的SPIO 標(biāo)記hbMSCs 普魯士藍(lán)染色呈陽性；透射電鏡檢查顯示胞漿內(nèi)含致密鐵顆粒；胎盼藍(lán)染色和MTT分析測(cè)定生長(zhǎng)曲線證實(shí)不同標(biāo)記濃

10、度的SPIO 標(biāo)記對(duì)hbMSCs 活性和增殖能力無影響(P>0.05)。
　　 2．SPIO 標(biāo)記的hbMSCs在外加磁力干預(yù)下的分布模式提示：SPIO標(biāo)記的hbMSCs主要聚集在培養(yǎng)孔的中心區(qū)域，而培養(yǎng)孔的邊緣區(qū)域很少有SPIO 標(biāo)記的hbMSCs分布。M 區(qū)細(xì)胞密度為150個(gè)/mm2，P 區(qū)細(xì)胞密度為10個(gè)/mm2。M 區(qū)細(xì)胞密度為P 區(qū)細(xì)胞密度的15倍，具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3.實(shí)驗(yàn)組，磁力作為物理因子趨化

11、SPIO 標(biāo)記的hbMSCs 跨過聚碳酸酯膜上的小孔到達(dá)下室。對(duì)照組只有少量SPIO 標(biāo)記的hbMSCs 遷移到達(dá)下室。兩組具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示磁力增強(qiáng)SPIO 標(biāo)記的hbMSCs的遷移能力。
　　 4．體外三維立體空間，磁靶向移植SPIO 標(biāo)記的hbMSCs 到達(dá)體外構(gòu)建的關(guān)節(jié)軟骨缺損模型①在外加磁場(chǎng)作用下，SPIO 標(biāo)記的hbMSCs 懸液并不是垂直下落，其運(yùn)動(dòng)軌跡偏向磁力產(chǎn)生的方向，精確的引導(dǎo)到靶點(diǎn)。超過85％的SP

12、IO 標(biāo)記hbMSCs 到達(dá)軟骨缺損中心。
　　 ②磁靶向移植SPIO 標(biāo)記的hbMSCs 90分鐘后，MR 掃描影像提示軟骨缺損區(qū)域顯著的信號(hào)減弱（p＜0.01）。信號(hào)強(qiáng)度衰減率(ΔSI)為78.7％。
　　 ③ H&E 染色見大量的hbMSCs 聚集在軟骨缺損區(qū)域形成“細(xì)胞板層”樣三維立體結(jié)構(gòu)，平均厚度有25 層hbMSCs。
　　 結(jié)論：
　　 本實(shí)驗(yàn)是一種新型的干細(xì)胞空間傳遞技術(shù)，增加軟骨損傷局部