Klotho在RIG-I介導的抗病毒天然免疫反應中的作用研究.pdf

1、天然免疫系統(tǒng)又稱固有免疫系統(tǒng)，在識別病毒感染、觸發(fā)信號級聯(lián)放大和誘導I型干擾素及炎癥反應等抗病毒細胞因子的表達過程中起著決定性作用?？共《咎烊幻庖呦到y(tǒng)中有兩種模式識別受體負責結合病毒復制過程中產(chǎn)生的雙鏈RNA：一種是定位于細胞質(zhì)膜及內(nèi)吞泡膜上面的Toll樣受體(Toll-likereceptors,TLRs)，能夠通過激活轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)節(jié)因子（interferonregulatoryfactor3,IRF-3）和核因子-κB(nucl

2、earfactor-κB,NF-κB)，誘導I型干擾素和炎癥因子的產(chǎn)生。另一種是定位于細胞質(zhì)內(nèi)可識別病毒雙鏈RNA的解旋酶受體維甲酸誘導基因I樣受體(RIG-Ilikereceptors,RLRs)。維甲酸誘導基因I(RetinoicacidinduciblegeneI,RIG-I)是第一個被發(fā)現(xiàn)的該家族的受體成員，在除漿細胞以外的幾乎所有細胞中都能發(fā)揮作用。RIG-I識別不同種類的RNA，激活抗病毒信號傳導通路，活化轉(zhuǎn)錄因子IRF-3

3、和NF-κB，最終誘導干擾素β（interferon-β,IFN-β）的合成。
　　Klotho是一種抗衰老蛋白，其基因缺失表現(xiàn)一系列衰老癥狀。近年來有報道Klotho在固有免疫中發(fā)揮作用，其與I型干擾素和白介素等抗病毒因子間存在聯(lián)系。然而，Klotho是否參與細胞抗病毒固有免疫很少受到關注。基于此，我們對Klotho在抗病毒天然免疫反應中的作用進行初步探索，為尋找和開發(fā)新型調(diào)節(jié)固有免疫的生物大分子奠定基礎。
　　為探討Kl

4、otho在抗病毒天然免疫反應中的作用，本研究首先觀察了Klotho對病毒入侵后干擾素表達的影響，并初步探討了其在RIG-I介導的抗病毒信號通路中的作用及其作用方式。主要研究內(nèi)容及研究結果如下：
　　1.通過基因轉(zhuǎn)染和RNA干涉技術過表達和干涉Klotho基因，結果發(fā)現(xiàn)其對病毒入侵后干擾素的表達具有正向調(diào)控作用。
　　2.通過在293T細胞中轉(zhuǎn)染PolyI:C模擬細胞內(nèi)的病毒刺激，證實了Klotho能通過胞內(nèi)途徑增強RIG-I

5、介導的抗病毒信號通路，進一步通過將該抗病毒通路中信號因子△RIG-I、MAVS、TRAF、TBKI、IKKε表達質(zhì)粒分別與Klotho表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，發(fā)現(xiàn)Klotho能通過影響“病毒感受器”RIG-I及其下游接頭蛋白—線粒體抗病毒信號蛋白（mitochondrialantiviralsignalingprotein,MAVS），特異性增強RIG-I介導的抗病毒信號通路。
　　3.分別將野生型Klotho和缺失信號肽的突

6、變體Kl△ss質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，病毒刺激或PolyI:C模擬胞內(nèi)刺激條件下，熒光素酶報告基因檢測IFN-β報告基因的活性，熒光定量RT-PCR和ELISA檢測IFN-β的表達水平。結果發(fā)現(xiàn)缺失信號肽的Klotho即胞內(nèi)Klotho蛋白不能誘導干擾素的表達。相反，外加Klotho蛋白或?qū)⑦^表達Klotho的培養(yǎng)基上清（即具有生物活性的Klotho蛋白）加入到RIG-I信號通路已被激活的培養(yǎng)基中，干擾素的表達明顯上調(diào)；而當細胞外的Klo