SCF復(fù)合體SCFFBXO21在抗病毒天然免疫中的功能及其機(jī)制研究.pdf

1、天然免疫系統(tǒng)是人體抵抗外來病原微生物感染的第一道防線，在病毒感染過程中，模式識別受體通過識別病毒中的病原相關(guān)分子模式啟動抗病毒天然免疫反應(yīng)及程序性的細(xì)胞死亡從而限制、抵抗病毒的感染。泛素化修飾是機(jī)體關(guān)鍵的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式之一，它發(fā)生在細(xì)胞活動的各個階段，在免疫應(yīng)答過程中也發(fā)揮著非常重要的作用，作為泛素化修飾過程中的關(guān)鍵分子，E3泛素連接酶在抗病毒天然免疫反應(yīng)過程中的新功能、新調(diào)控方式的研究一直是免疫學(xué)研究的熱點問題。因此，本實驗室對

2、病原微生物刺激后的小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行了E3泛素連接酶表達(dá)譜芯片的分析，從該芯片結(jié)果中，我們關(guān)注到了一群以往在天然免疫中功能鮮有報道的E3泛素連接酶家族SCF復(fù)合體(SKP1-CUL1-F-BOX protein complex)，該復(fù)合體的標(biāo)志性蛋白為發(fā)揮底物蛋白識別功能的F-BOX蛋白，我們分析了芯片結(jié)果中F-BOX蛋白的表達(dá)量及反應(yīng)性并選擇了8個功能未知的FBXO蛋白篩選了它們在抗病毒天

3、然免疫中的功能，從中確定了SCFFBXO21作為我們進(jìn)一步研究的對象。
　　在本研究中我們發(fā)現(xiàn)了FBXO21在抗病毒天然免疫及病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中發(fā)揮著重要的作用。在小鼠原代巨噬細(xì)胞及RAW264.7細(xì)胞中，干擾FBXO21可以明顯抑制VSV病毒及HSV病毒所刺激的IL-6，IFN-β的產(chǎn)生。利用免疫共沉淀、質(zhì)譜分析技術(shù)以及Western blot實驗發(fā)現(xiàn)了FBXO21可以與ASK1相互結(jié)合并且對其進(jìn)行K29多聚泛素化修飾。ASK

4、1是TLR信號及凋亡信號中的關(guān)鍵調(diào)控分子，但是它在抗病毒天然免疫中的功能以及修飾方式還不明確。因此我們對ASK1在抗病毒天然免疫中的修飾和功能做了深入分析。
　　利用CRISPER/CAS9基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建FBXO21表達(dá)缺陷的RAW264.7細(xì)胞后，用VSV、HSV刺激細(xì)胞，F(xiàn)BXO21-/-RAW264.7細(xì)胞中ASK1的K29多聚泛素化水平明顯低于對照組，下游的JNK、P38、TBK1、IRF3的磷酸化水平以及IL-6、IF

5、N-β的表達(dá)也明顯的降低，但病毒在其中的復(fù)制卻明顯的增強(qiáng)。另一方面，在VSV、HSV刺激細(xì)胞后，F(xiàn)BXO21表達(dá)缺陷的細(xì)胞的死亡也明顯的弱于對照組。利用ASK1激酶活性缺失以及泛素化位點突變的載體進(jìn)行實驗后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BXO21對ASK1進(jìn)行的泛素化修飾可以促進(jìn)其激酶活性從而活化下游抗病毒及細(xì)胞死亡信號。信號通路抑制劑的研究發(fā)現(xiàn)JNK1/2是FBXO21-ASK1下游活化的關(guān)鍵信號通路。通過以上的研究，我們得出了以下結(jié)論:FBXO21可以通