褪黑素對缺血再灌注損傷HepG2細胞的NF-κBp65表達、分布和自噬的影響.pdf

1、目的：肝臟缺血再灌注損傷常發(fā)生于肝切除、失血性休克、外傷及肝移植手術，病理生理過程極其復雜。如何減輕肝臟在缺血再灌注過程中的損傷，進而保護肝細胞的正常功能有著十分重要的臨床意義。最近的研究發(fā)現(xiàn)細胞自噬參與缺血再灌注損傷過程，但是自噬對細胞的存活是利是弊仍未有定論。本研究擬從自噬活性調(diào)控方面探討褪黑素對缺血再灌注損傷的HepG2細胞保護機制。
　　方法：（一）細胞模型的制作及實驗分組：1、缺血再灌注模型制作：選擇狀態(tài)良好的、80％生

2、長融合的HepG2細胞進行試驗，棄培養(yǎng)液，加入等量的PBS平衡液，置于通有5％CO2和95％N2的37℃培養(yǎng)箱中120 min，即模擬缺血120 min（缺血清、缺糖、缺氧，OGD），棄掉PBS平衡液，加入含或不含Mel或PDTC（NF-κB的抑制劑）的正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)0 h、1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h，即模擬再灌注。2、實驗分組：分為六組，（1）正常組（N組）；（2）缺血再灌注組（IR組）：HepG2細胞模擬

3、缺血120 min，更換正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)0 h、1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h。（3）Mel處理組（IRM組）：HepG2細胞模擬缺血120 min，再灌注時加褪黑素（100μmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h；（4）Mel預處理組（MIRM組）：HepG2細胞用Mel（100μmol/L）預處理12 h，模擬缺血120 min，再灌注時加Mel繼續(xù)培養(yǎng)0 h、1 h、3 h、6

4、 h、9 h、12 h、24 h。（5）PDTC處理組（IRP組）：HepG2細胞模擬缺血120 min，再灌注時加PDTC（200μmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h；（6）PDTC預處理組（PIRP組）：HepG2細胞用PDTC處理12h，模擬缺血120 min，再灌注時加PDTC（200μmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)0 h、1 h、3 h、6h、9h、12h、24h；（二）樣本采集：在不同時間點收集細胞

5、提取胞漿蛋白和胞核蛋白。（三）Western blot檢測蛋白表達：自噬相關蛋白—LC-3，Beclin1；核轉(zhuǎn)錄因子—NF-κBp65；以及MEK2。（四）MTT法檢測細胞活力。
　　結(jié)果：（一）Mel和IR對HepG2細胞NF-κBp65的表達和分布的影響：（1）缺血再灌注（IR組）對HepG2細胞總的p65表達沒有影響，同正常組相比較p>0.05，差異無顯著性；但是，胞漿中的p65水平隨著再灌注時間的延長呈現(xiàn)出先降低后升高的

6、變化趨勢，再灌注1 h、3 h、6 h、9 h表達低下，與正常組相比較，p<0.05差異有顯著性，再灌注12 h逐漸恢復至正常水平；胞核中p65水平則呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，在再灌注0 h、1 h、3 h明顯增高，與正常組相比較p<0.05，差異著性，再灌注6h后逐漸恢復至正常水平，結(jié)果表明缺血再灌注損傷在早期促進HepG2細胞胞漿中p65向胞核轉(zhuǎn)位。（2）HepG2細胞IR后用Mel治療（IRM組）結(jié)果顯示，總的p65表達無變化，

7、同IR組和正常組相比較p>0.05，差異無顯著性；雖然胞漿中p65水平在再灌注6 h前有下降趨勢，且同正常組相比較p<0.05，有顯著性差異，但同IR組相比較，IRM組細胞胞漿p65水平明顯高于同一時間點IR組；胞核中p65水平在再灌注6 h前高于正常組，但是低于同一時間點IR組p<0.05，差異具有顯著性，結(jié)果表明Mel可以部分抑制缺血再灌注誘導的p65核轉(zhuǎn)位。（3）如果先用Mel預處理HepG2細胞12 h，再進行IR和Mel治療（

8、MIRM組)，處理前后對HepG2細胞總的p65表達沒有影響，同正常組相比較p>0.05，差異無顯著性；胞漿中p65水平只在IR1 h前輕微下調(diào)，與正常組相比較，p<0.05，差異具有顯著性，在IR3h后恢復至正常水平，與正常組相比較，p>0.05，差異無顯著性，同IR組相比較，p<0.05，差異具有顯著性；胞核中p65水平除了IR0 h、1 h明顯高于正常組，其他各時間點與正常組比較無顯著性差異，同IR組和IRM組比較，明顯降低，p<

9、0.05，差異具有顯著性。結(jié)果表明Mel預處理比Mel治療具有更好的抑制IR促進HepG2細胞p65核轉(zhuǎn)位的作用。
　?。ǘ㎝el和IR對HepG2細胞自噬相關蛋白的表達的影響：（1）隨著IR時間的延長，總的LC-3的水平和LC-3Ⅱ含量逐漸增加，與正常組相比有顯著性差異（*p<0.05）；Mel治療后各時間點的LC-3 II含量也明顯高于正常組，＃＃p<0.01差異具有極顯著性，但是同一時間點相比較，IRM略低于與IR組，特別

10、是IR24 h，Mel顯著抑制了LC-3Ⅱ升高（$p<0.05）。（2）隨著IR時間的延長，Beclin1的表達逐漸增高，與正常組相比有顯著性差異（*p<0.05）；Mel治療后，Beclin1的表達在0 h、1 h、3 h略高于正常組（＃p<0.05），6 h后與正常組無差異，與IR組相比較，IR6 h前，兩組各時間點之間變化無差異，但是IR9 h后，Mel組明顯低于IR組，差異顯著（$p<0.05）。結(jié)果表明Mel能有效抑制IR誘導

11、的HepG2細胞發(fā)生過度自噬。
　?。ㄈ┩屎谒睾虸R對MEK2表達的影響：隨著IR時間的延長，MEK2的表達表現(xiàn)出先升高后下降的變化趨勢，各時間點與正常組相比較，都顯著性增加（*p<0.05），IR3h升高最明顯。加入褪黑素后，IR3h的MEK2的表達水平明顯降低，*p<0.05，結(jié)果表明Mel可以抑制IR促進HepG2細胞MEK2的表達。
　　結(jié)論：（1）IR促進HepG2細胞NF-κBp65的核轉(zhuǎn)位，而Mel可以抑制I