對Nrf1D亞細(xì)胞定位及降解過程的研究.pdf

1、研究背景：
　　近年來，Nrf2作為細(xì)胞內(nèi)最重要的氧化應(yīng)激分子開關(guān)已引起人們的廣泛關(guān)注，然而，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)其同源性分子Nrf1有著Nrf2不可彌補(bǔ)的作用，因而，越來越多的研究者將注意力從Nrf2轉(zhuǎn)移至Nrf1。多年研究發(fā)現(xiàn)，Nrf1在轉(zhuǎn)錄后會產(chǎn)生多種剪接突變體。而Nrf1D就是其中之一，與全長Nrf1相比，Nrf1D不再包含功能性翻譯終止子(2267-2270bp)，而且還導(dǎo)致亮氨酸拉鏈序列的后半部分也發(fā)生改變。其N端66

2、9個氨基酸與Nrf1完全一致，而在這669個氨基酸之后，原來Nrf1靠近C端72個氨基酸被另外80個氨基酸取代。并且研究得知，這80個氨基酸對Nrf1D起負(fù)調(diào)控作用。這80個氨基酸中還包含一個42個氨基酸的分支，該分支與另一種bZIP蛋白(fra2)在亮氨酸拉鏈的相同的位置有明顯同源性。雖然，Nrf1D已經(jīng)被證明確實是存在的，但對其蛋白表達(dá)方面尚未進(jìn)行探究。既然活細(xì)胞成像技術(shù)可以應(yīng)用于膜蛋白降解過程的動態(tài)研究，那么，Nrf1表達(dá)蛋白作為

3、一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白，其全長以及各種突變亞型也可以用此技術(shù)做相應(yīng)研究。
　　研究目的：
　　運用RT-PCR分析Nrf1D存在的組織，再用藥物預(yù)處理后通過雙熒光素酶報告基因檢測技術(shù)和Westernblotting技術(shù)檢測這幾種藥物對Nrf1D蛋白表達(dá)量的影響，最后再結(jié)合活細(xì)胞成像分析Nrf1多種突變亞型降解的動態(tài)變化。
　　研究方法：
　?、俜崔D(zhuǎn)錄PCR實驗定位Nrf1D；②雙熒光素酶報告基因檢測技術(shù)和Western

4、blotting技術(shù)檢測這幾種藥物(DTT(0,0.5mM,1mM)、維生素C(0,100μM,200μM)以及tBHQ(0,25μM，50μM)處理24h，TPA(0,100nM,200nM)處理4h)對Nrf1D表達(dá)量的影響；③活細(xì)胞成像分析Nrf1多種亞型的動態(tài)變化。
　　實驗結(jié)果：
　?、賀T-PCR分析得出：Nrf1D存在于骨髓中。
　?、谕ㄟ^活細(xì)胞成像實驗發(fā)現(xiàn)Nrf1D比Nrf1降解的慢。
　　當(dāng)相同

5、質(zhì)量的Nrf1、Nrf1D以及Nrf1Δ670-741與ER-DsRed共轉(zhuǎn)COS-1細(xì)胞時，首先可以觀察到三種蛋白均定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。在用Digitonin(20μg/ml)處理細(xì)胞10min時，只有Nrf1有較明顯的降解，而Nrf1D以及Nrf1Δ670-741幾乎無降解。然后再加入ProtinaseK(50μg/ml)，三者均處理30min發(fā)現(xiàn)：Nrf1會完全降解，而Nrf1D和Nrf1Δ670-741依然大量未被降解。
　　

6、③雙熒光素酶報告基因檢測技術(shù)和Westernblotting技術(shù)檢測出：(1)DTT、維生素C以及tBHQ對Nrf1D的活性起到正調(diào)控作用；(2)TPA發(fā)揮負(fù)調(diào)控功能；(3)上述藥物對其表達(dá)量的影響均存在一定的劑量依賴性；(4)這些藥物主要是影響糖基化的蛋白亞型。
　?、芑罴?xì)胞成像技術(shù)研究得出的多種Nrf1亞型動態(tài)降解的快慢是不同的。實驗結(jié)論：
　?、傧鄬τ贜rf1C端的72個氨基酸而言，Nrf1DC端的80個氨基酸對其活性