家蠶新基因Bm-X的表達(dá)及亞細(xì)胞定位研究.pdf

1、在對(duì)家蠶蛹cDNA文庫(kù)測(cè)序中，篩選到一個(gè)家蠶未知功能基因Bm-X，通過(guò)對(duì)其cDNA序列生物信息學(xué)分析。該cDNA序列全長(zhǎng)為778bp，開(kāi)放閱讀框(OgF)長(zhǎng)444bp，其編碼的蛋白質(zhì)Bm-X，全長(zhǎng)147個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)相對(duì)分子量為16.4kDa，等電點(diǎn)為3.69，為無(wú)信號(hào)肽的非分泌的酸性蛋白。 經(jīng)PCR擴(kuò)增得到Bm-X基因片段，經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后，插入相應(yīng)酶切后質(zhì)粒pET-28a(+)，構(gòu)建重組融合蛋白表達(dá)載體pE

2、T-28a(+)-Bm-X,經(jīng)PCR、酶切鑒定重組正確。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosseta(DE3)菌株感受態(tài)細(xì)胞，篩選重組菌株后以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，裂解菌體作SDS-PAGE分析，在20.1kD處有一濃集的特異性蛋白條帶，表達(dá)量可達(dá)菌體總蛋白的50％左右。融合蛋白以可溶形式存在，超聲波裂解菌體后離心收集上清液，采用鎳離子親和層析柱純化重組融合蛋白rBm-X。以該融合蛋白為抗原免疫雄性新西蘭兔制備了多克隆抗體，ELISA檢測(cè)該抗